内容提要
本文研究了一系列具有强近红外发射的次氯酸（HClO）激活化学发光探针。这些探针是专门针对急性炎症的已知生物标志物 HClO 设计的，通过消除对持续外部激发的需求，实现了高对比度的体内成像。综合实验和理论研究表明，探针的化学发光取决于乙烯键的反应性，遵循氧化化学发光分子的协同分解过程。这些化学发光纳米颗粒在体内的应用有助于急性炎症的高对比度成像，实现了炎症状况的实时、高对比度可视化。
化学发光发射对分子结构的依赖性
使用不同的供体设计了八种化学发光化合物，即 2PxzCN、2PxzphCN、2CzCN、2CzphCN、2DPACN、2TPACN、2MeODPACN 和 2MeOTPACN。前体化合物通过布赫瓦尔德 - 哈特维格（Buchwald–Hartwig）和铃木偶联反应合成。随后与丙二腈反应，通过克脑文盖尔缩合（Knoevenagel condensation）得到目标化学发光分子。值得注意的是，2TPACN 经过两步合成，总产率为 67%。合成路线和结构表征，包括核磁共振（NMR）和质谱，见支持信息。所有八种分子都表现出聚集诱导发光（AIE）特性）。由于这些化学发光化合物是疏水性的，使用两亲性三嵌段共聚物（F127）作为表面活性剂在水溶液中封装它们以制备化学发光纳米颗粒（CL - NPs）。所有纳米颗粒的流体动力学直径都在 60 - 100 nm 的期望范围内，并且在超过十天的悬浮液中表现出优异的稳定性。以 2TPACN - NPs 为例，动态光散射（DLS）显示其平均流体动力学直径约为 72 nm，透射电子显微镜（TEM）图像证实其主要为球形形态。
详细研究和比较了合成的化学发光分子的光学性质。由于这些化合物中供体基团的变化，CL - NPs 的紫外 - 可见吸收峰最大值从 400 nm 移至 500 nm，表明它们具有不同的分子内电荷转移效应。相应地，它们的荧光发射从黄色区域（560 nm）移至近红外区域（720 nm）。因此，分别使用 IVIS Spectrum 成像系统在荧光和生物发光模式下测量 CL - NPs 的荧光和化学发光信号。根据它们的光物理光谱，选择吸收和荧光的最佳波长分别作为荧光成像的激发和发射波长，并优化生物发光模式（无激发）的曝光时间）。所有 CL - NPs 在 600 - 750 nm 范围内都表现出荧光和 ClO⁻激活的化学发光发射。CL - NPs 的化学发光发射强度趋势与荧光强度趋势存在一些差异。在存在 ClO⁻的情况下，所有 CL - NPs 的荧光强度逐渐降低。2TPACN - NP 探针表现出最强的化学发光，并且在加入 NaClO 后，产生持续超过 90 分钟的持续化学发光。在化学激发过程中，最大化学发光信号出现在初始状态，并且未观察到化学发光强度逐渐增加到相对稳定的峰值，这表明反应高效。重要的是，与 ClO⁻反应后，纳米颗粒在很大程度上保持了其尺寸和稳定性，这对于它们在后续体内成像应用中的有效性能至关重要。
选择 2TPACN - NPs 进一步研究其对各种活性氧和氮物种（RONS）如 O₂⁻、¹O₂、*OH、H₂O₂ 和 ONOO⁻的化学发光选择性，证明了其对 ClO⁻的选择性。为了进一步阐明图中观察到的选择性，我们测量了 2TPACN 在不同活性氧物种（ROS）存在下的荧光强度变化。这一趋势与化学发光实验中观察到的选择性模式一致，证实了 2TPACN 对 ClO⁻的特异性。值得注意的是，2TPACN - NPs 的化学发光发射强度与 ClO⁻浓度呈线性相关，检测限为 23.35 nm。2PxzCN 和 2PxzphCN 尽管荧光性能较差，但表现出中等的化学发光强度。相比之下，2DPACN 表现出最强的荧光强度，而 2TPACN 显示出最高的化学发光发射，表明分子取代基显著影响荧光和化学发光过程。CL - NPs 的荧光和化学发光行为的这些差异突出了两种发射形式之间的相互作用。然后使用化学发光 / 荧光强度比来估算化学发光探针的反应性随着供体基团电子供体能力的增加，化学发光探针的荧光峰逐渐红移，同时化学发光 / 荧光强度比增加。这一观察结果表明，引入高电子供体基团有利于丙二腈的乙烯键对 ClO⁻的反应性。然而，当供体基团非常强（例如吩恶嗪）时，由此产生的分子内电荷转移效应可能导致化学发光探针的荧光发射猝灭，这将限制整体化学发光性能的进一步提高。因此，需要精确控制化学发光探针的分子结构。CL - NPs 的荧光和化学发光发射光谱的一致性表明，二氧杂环丁烷的后续分解将能量转移到化学发光分子，使其激发，然后在弛豫到基态时发出化学发光。
化学发光机制的研究
由于 2TPACN 具有显著的化学发光强度，因此被选用于深入研究化学发光机制。向四氢呋喃（THF）溶液中加入水时，2TPACN 的荧光强度最初会降低。这种降低可能是因为水相对于 THF 的极性更高，这有利于扭曲的分子内电荷转移（TICT）并导致荧光猝灭。随后继续加水会导致荧光强度逐步增加，这是纳米聚集体的一个标志，从而证实了 2TPACN 的聚集诱导发光（AIE）特性，这在生物应用中具有重要潜力。
在与 ClO⁻孵育后，对 2TPACN 的光物理性质进行了分析，以阐明其化学发光发射的机制。向 THF / 水混合物（1:99 v/v）中加入 ClO⁻导致 455 nm 处的特征吸收峰显著降低，并在 420 nm 处出现新峰，这表明形成了 2TPACN 分解产物。同时 640 nm 处的荧光发射降低证实了 2TPACN 的分解。在纯 THF 中的综合分析显示，660 nm 处的发射峰降低，而 490 nm 处出现新的发射峰，并且随着 ClO⁻孵育时间的延长而增加，这表明荧光从红色变为亮黄色。这些结果证实了 2TPACN 的分解和新光产物的形成。傅里叶变换红外光谱（FTIR）、质谱和高效液相色谱（HPLC）被用于确定反应产物的组成。FTIR 光谱显示，在 ClO⁻孵育的 2TPACN 样品中，2221 cm⁻¹ 处的氰基峰消失，1654 cm⁻¹ 处出现明显的特征羰基峰，这表明形成了含羰基的分解产物。质谱分析证实了这些发现，m/z 668.27555 处的质量峰对应于 2TPACN 的前体分子。HPLC 结果证实了新产物 2TPACO 的存在，其保留时间与 2TPACN 不同，对应于含 C═O 的氧化产物。根据它们的峰面积，2TPACN 到 2TPACO 的转化率高达 41.36%。使用硅胶柱色谱对分解产物进行纯化，随后进行 ¹H NMR 光谱分析，证实了 2TPACO 的化学结构。鉴于观察到的 2TPACN 的近红外化学发光发射特性，我们测量了合成的 2TPACO 的光物理性质。值得注意的是，2TPACO 在 490 nm 处的发射带与 2TPACN 在 THF / 水混合物（1:99 v/v）中的吸收带重叠。考虑到 2TPACN - NPs 在与 ClO⁻孵育后的近红外化学发光发射，应该发生了从 2TPACO 到 2TPACN 的福斯特共振能量转移（FRET）过程。此外，2TPACN 在 THF 中的化学发光发射与其在纳米颗粒中的发射相比蓝移了 90 nm，这表明在有机溶剂环境中能量转移效率较低。这种 FRET 效率的降低源于 2TPACO - 2TPACN 对之间距离的增加，因为分子分散在 THF 溶液中。因此，通过在纳米颗粒内使分解产物和化学发光分子之间有显著的光谱重叠和紧密接近来优化这种能量转移，实现了高效的近红外发射。由于强近红外发射增强了深层组织成像能力，我们的系统非常适合生物应用。基于这些结果，我们提出 2TPACN 对 ClO⁻的以下氧化途径：1）2TPACN 中的碳 - 碳双键被氧化形成过氧化物，导致 2TPACN - 二氧杂环丁烷中间体的形成。2）2TPACN - 二氧杂环丁烷随后分解，形成激发态的 2TPACO。3）然后通过从激发态 2TPACO 到 2TPACN 基态的能量转移发生近红外化学发光发射。对 2MeOTPACN 的类似表征证实了与 ClO⁻反应过程的普遍性。
为了确定这些化合物的电子云分布，使用 Gaussian 09 程序在 B3LYP/6 - 311G** 水平上进行了密度泛函理论（DFT）计算。最高占据分子轨道（HOMO）主要位于供体基团中，最低未占据分子轨道（LUMO）集中在受体上。随着电子供体的变化，化学发光分子的能隙显示出明显的变化，这与上述研究的光物理性质一致。如 2TPACN 化学发光的提出机制所示，2TPACN 的乙烯键（C = C）通过次氯酸盐的 π² - π² 环加成被氧化为不稳定的 2TPACN - 二氧杂环丁烷中间体；不稳定的中间体随后分解为含羰基的产物，从而产生光子。基于提出的响应机制，氧化的 2TPACN - 二氧杂环丁烷的分解至关重要。为了阐明分解机制并探索相应的发光过程，采用 DFT 计算来分析基态分子几何结构和能量分布。采用含时密度泛函理论（TD - DFT）计算在 B3LYP/6 - 31G和 UB3LYP/6 - 31G理论水平上研究激发态。这些分析揭示了与二氧杂环丁烷解离相关的极小值和过渡态。为了研究二氧杂环丁烷的分解途径，我们考虑了涉及 O - O 和 C - C 键断裂的两种情况。，优化后的几何结构显示这些键的伸长具有可变的键长。我们的计算分析确定了两个潜在的基态过渡态（TS）：第一个以 CC 键断裂为特征（TS₀），第二个以 O - O 键断裂为特征（TS’₀）。TS₀和 TS’₀的计算活化能分别为 15.23 和 20.50 kcal mol⁻¹，表明这两种可能状态之间的能量差较小。所得的能量分布证实了产物的较低能量，表明这是一个放热分解过程。使用 DFT 进行了内禀反应坐标（IRC）搜索以验证提出的机制。值得注意的是，在 TS₀和 TS’₀附近的单重激发态（S₁）的势能面上有显著的能量下降，这表明在 S₁能量面上形成了一个 “漏斗”。计算得到的 S₀和 S₁之间的能隙分别为 8.72 和 3.18 kcal mol⁻¹，这意味着出现了一个近简并区域，有利于从基态到激发能面的电子激发和光子发射。因此，综合的结构分析和理论计算表明，适当的活化能、近简并区域和到达激发态的低能垒共同支持了氧化的 2TPACN 的协同分解机制。这种机制有利于化学激发，使其成为控制观察到的化学发光的最可能途径，并为化学发光过程的可行性和合理性提供了可靠的证据。
体内高对比度化学发光成像
我们确定 2TPACN - NPs 的近红外化学发光发射强度与 HClO 的浓度（24、32、48、64、80、160、240、320 和 400 μM）成正比。此外，2TPACN - NPs 对细胞没有显著的细胞毒性，这表明它们适用于定量体内成像。
为了突出 2TPACN 的近红外化学发光用于体内成像相对于传统荧光的优势，我们在荧光和化学发光成像模式下进行了对比成像研究。将探针（含 0 μM 或 200 μM ClO⁻的 2TPACN - NPs）皮下注射到小鼠背部后，获得了化学发光和荧光图像。比较在无 ClO⁻（0 μM，“关闭状态”）和有 ClO⁻（200 μM，“开启状态”）时的图像，化学发光成像显示当探针处于 “开启” 状态时信号有显著增强，信噪比（56.49）超过了荧光成像的信噪比（16.39）。相比之下，近红外荧光信号因 ClO⁻的存在而降低，这是由于 2TPACN 的分解导致 “ClO⁻ - 200 μM” 组荧光成像对比度降低。与荧光成像相比，化学发光成像具有更高的信噪比和显著的增强（Ion/Ioff），这使得 2TPACN - NPs 在体内化学发光成像中具有更高的灵敏度。这种增强的成像能力能够精确定位富含 ClO⁻的区域，从而提高监测疾病进展的能力，而这对于传统荧光成像技术来说是具有挑战性的。为确保实验准确性，我们进行了一项对照实验，先注射探针，然后在同一部位再次注射 200 μM 的 ClO⁻；这种改进使得成像性能得到了提高（图 S23，补充信息）。
体内脂多糖（LPS）诱导的急性炎症成像
急性炎症是对创伤、微生物入侵和其他形式损伤的关键生理反应，其主要目的是消除病原体、清除受损细胞和组织以及启动组织再生。然而，在严重的急性炎症事件中，细胞因子的过度和失调释放会引发全身炎症反应综合征，最终导致多器官功能障碍并可能导致死亡。因此，对急性炎症的密切监测和管理对于减轻危及生命的并发症至关重要。根据先前的研究，中性粒细胞是急性炎症期间被招募到炎症部位的第一批反应细胞，推动炎症的发展并有助于其消退。髓过氧化物酶（MPO）是血红素过氧化物酶家族的重要成员，在多种炎症细胞中高度表达。吞噬细胞杀菌系统中 MPO 的激活催化氯化物和 H₂O₂的过氧化反应，产生 HClO，这是一种对生物至关重要的活性氧物种，它参与一系列重要过程，包括信号转导、神经退行性损伤、炎症和癌症。由于 MPO 活性增加，HClO 的浓度会升高。由于 LPS 可以刺激巨噬细胞和中性粒细胞产生 HClO，因此 2TPACN - NPs 被用于监测 LPS 诱导的急性炎症期间内源性 ClO⁻的水平。在接受 2TPACN - NPs 处理并受到 LPS 刺激的小鼠中，同时使用 PBS 和牛磺酸（一种可透过细胞膜的 ClO⁻清除剂）设计并进行了对照实验。
由于 2TPACN - NPs 对 ClO⁻的化学发光信号响应增强且信噪比优异，2TPACN 被用作 ClO⁻响应性化学发光探针来监测急性炎症。在 LPS 处理后 3 小时，将 2TPACN - NPs 腹腔注射，以便在不同时间点进行体内纵向化学发光成像。感兴趣区域的化学发光信号强度呈现自然衰减，但在 20 分钟内仍保持相对较强的化学发光强度。余辉图像的信噪比也显示出高强度水平，并且也呈现自然衰减，在 20 分钟的成像过程中保持 14.89 的信噪比。高信噪比使得炎症部位能够与正常部位区分开来，从而能够持续监测整个急性炎症过程。与 LPS 组相比，对照组分别腹腔注射 PBS 缓冲液以及 LPS 和牛磺酸（LPS 注射 10 分钟后）。这两个对照组在 3 小时后腹腔注射 2TPACN - NPs，并获取化学发光图像。LPS 组的化学发光强度明显高于 PBS 组和牛磺酸 + LPS 组。化学发光图像的量化直方图表明，LPS 组的信噪比约为牛磺酸 + LPS 组的 7.7 倍，这表明牛磺酸起到了 ClO⁻清除剂的作用。接受 LPS 处理的小鼠的化学发光强度明显高于接受牛磺酸处理的对照组，这表明 2TPACN 具有出色的光学成像性能，可被开发为一种用于体内炎症监测的灵敏化学发光探针。为了评估纳米探针的体内生物安全性和生物相容性，使用苏木精和伊红（H&E）染色进行了组织学分析。与对照组相比，接受 2TPACN - NPs 处理的小鼠的主要器官（包括心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏）的 H&E 染色切片未显示任何明显的病变或组织学异常。这表明 2TPACN - NPs 具有出色的生物相容性和生物安全性。尽管所开发的化学发光探针 2TPACN - NPs 在分子设计和易于修饰方面具有优势，但其整体信号强度仍需要优化，以达到更成熟和已建立系统的水平。
总结
我们引入了一类新的次氯酸（HClO）响应性化学发光（CL）探针，推进了化学发光成像方法。通过简单的合成路线获得了八种化学发光探针，这使得化学发光平台易于修饰。引入不同的供体使发射波长能够在 600 至 750nm 之间变化。2TPACN 在近红外区域表现出最强的化学发光信号，持续时间超过 90 分钟。通过结构产物分析和理论计算支持了所提出的 2TPACN 化学发光的分子机制。HClO 通过 π² - π² 环加成氧化乙烯键形成 2TPACN - 二氧杂环丁烷中间体。2TPACN - 二氧杂环丁烷的协同分解随后产生激发态系统，该系统随后通过近红外化学发光发射弛豫。2TPACN - NP 纳米平台产生强烈的化学发光信号，并实现了 24.77 的高信噪比，在急性炎症的生物成像和监测中，20 分钟后仍保持 62%。我们的研究结果为炎症性疾病提供了有价值的见解，并证实了化学发光成像在推进生物医学研究和临床诊断中的不可或缺的作用。
参考文献
HClO-Activated Near-Infrared Chemiluminescent Probes with a Malononitrile Group for In-Vivo Imaging,Yalei Cao, Juqing Gu, Zhijian Chen, Jucai Gao, Jie Yang,*Wenbo Wu, Manman Fang, Qianqian Li, Bin Liu,* and Zhen Li*,Adv. Mater. 2024, 2408941,https://doi.org/10.1002/adma.202408941
