内容提要
本文采用模块化合成路线构建了一系列最大发射波长可达 1060 nm 的直接激活的 NIR-II 化学发光发射单分子探针，并在 NIR-II 化学发光和 NIR-II 荧光成像通道下，将其用于对雌性小鼠模型中对乙酰氨基酚诱导的肝损伤所产生的超氧阴离子进行实时且连续的检测。因此，本研究建立了一种可直接激活的 NIR-II 化学发光发射单分子骨架，验证了这种双模式 NIR-II 化学发光/荧光成像平台在生物活性分子检测和疾病诊断中的可扩展性。
近红外化学发光探针的合成与表征
用四丁基氟化铵（TBAF，一种 F⁻ 供体）处理时，经 TBS 修饰的保护基团被去除，释放出不稳定的酚盐（I），其分解生成处于激发态的苯甲酸酯（II）。当苯甲酸酯衍生物的化学激发态弛豫到基态时，会同时释放出光子。在 TBAF 处理前获取了CL-O1 和CL-O2 的吸收光谱。由于聚甲炔长度从二甲炔延长到四甲炔，CL-O2的最大吸收峰比CL-O1略有红移。与TBAF反应后，FL-O1和 FL-O2的新吸收光谱比其相应的CL探针红移更显著。FL-O2的最大吸收峰比 FL-O1长得多。正如预期的那样，当聚甲炔链的桥延长时，CL-O2的最大 F 激活的 CL 发射峰达到 845nm，与 CL - O1 相比红移了约 85nm。在激光辐射下获取了苯甲酸酯 FL-O1和FL-O2的相应荧光发射光谱，并与它们的CL发射光谱（CL-O1和CL-O2）进行比较。FL-O2的最大发射波长（853nm）比 FL-O1（762nm）长得多，并且FL-O1和FL-O2的最大发射峰与其相应的CL发射峰（CL-O1和CL-O2）很好地匹配。FL-S3（761 nm）的吸收波长比FL-Se3（735 nm）红移得更多。CL-S3（1060 nm）和CL-Se3（1025 nm）的最大CL发射峰相对于CL-O3（980 nm）显著红移。与CL-S3相比，CL-Se3 表现出明显的蓝移。因此，在 F 响应后，CL - S3 在这三个骨架中实现了最大的吸收 / 发射波长。
近红外二区化学发光与荧光成像
荧光模式下外部激发时光子 - 组织相互作用包括界面反射（黄色）、散射（绿色）、吸收（黑色）和自发荧光（青色），所有这些相互作用都会降低信号强度并产生干扰噪声。相比之下，由于消除了激发光，化学发光模式显示出光子 - 组织相互作用减少且背景信号低。受上述结果的鼓舞，通过近红外二区化学发光和近红外二区荧光通道，在生物组织模拟物中进行了组织穿透实验。在一个小培养皿中用四丁基氟化铵（TBAF）激活一系列近红外二区化学发光探针，然后立即用不同厚度的模拟组织覆盖，从而实现实时双通道成像。当激活的探针上没有模拟组织时，在这三种探针中，CL-S3 明显产生了最亮的近红外二区化学发光强度和最高的信噪比（43.5）。当用不同厚度的模拟组织覆盖时，在近红外二区化学发光和近红外二区荧光通道中，可检测信号都明显衰减。特别是，CL-S3 的检测阈值达到了 1.2cm，而 CL-O3 和 CL-Se3 在 0.9cm 和 0.6cm 时几乎检测不到。在 0.6cm 深度处，CL-S3 的信噪比高达 13.5，分别比 CL-O3（7.7）和 CL-Se3（2.2）高 1.7 倍和 6.8 倍。在这三种探针中，CL-S3 具有最大的穿透深度和最佳的成像效果。虽然 CL-O3 具有最高的化学发光亮度，但由于使用了1000 nm长通相机镜头，1000 nm之前的光未被收集，导致其穿透深度比 CL-S3 浅。同时，激活的近红外二区荧光成像是在 808nm 激光下获得的，其获取的信号随着模拟组织深度的增加而降低。首先，当没有模拟组织覆盖时，FL-S3 达到了最高的信噪比（6.5），最大可检测组织深度为 0.6cm。由于收集窗口更集中，在深度达到 0.3cm 时，FL-S3 的信噪比（3.3）高于 FL-O3（2.4）和 FL-Se3（1.4）。与近红外二区荧光成像相比，近红外二区化学发光成像在穿透深度和成像质量方面具有显著优势。
对乙酰氨基酚诱导的肝毒性中的体内多重成像
对乙酰氨基酚（APAP）是一种常见的镇痛药和退烧药，过量服用 APAP 会导致药物性急性肝衰竭。APAP的毒性主要由一种代谢物N-乙酰-p-苯醌亚胺（途径 a）引发，它会迅速消耗谷胱甘肽（途径 b）并与线粒体膜蛋白结合，导致氧化 / 硝化应激和线粒体损伤（途径 c）。因此，大量的活性氧物质（如超氧阴离子、过氧化氢和次氯酸（HClO））及其他有毒的活性分子产生，进而导致肝损伤。为了验证近红外二区化学发光（NIR-II CL）在体内成像的优越性并进行互补的双通道成像，使用 CL - P 在对乙酰氨基酚（APAP）诱导的肝毒性模型中对超氧阴离子进行了实时和纵向的双重检测（NIR-II CL/FL）。CL - P 是使用中间体 O3 成功合成的，并通过 NMR、 NMR 和高分辨率质谱（HRMS）进行了全面表征。同时，对 CL - P 进行了相关表征，包括特征光谱、选择性、稳定性、动力学曲线和生物相容性。这些数据表明，CL - P 在对响应时能产生具有高选择性和灵敏度的激活的双重 NIR-II CL/FL 信号。
首先向活体小鼠腹腔内注射不同剂量的对乙酰氨基酚（APAP），随后在 APAP 处理 5 小时后静脉注射 CL - P。当小鼠预先接受肝毒性剂量（80mg/kg）的 APAP 处理时，在 1 分钟时观察到最大的近红外二区化学发光（NIR-II CL）强度，其比对照组高 2.7 倍。此外，其 NIR-II CL 强度在 3 分钟时急剧下降并在 8 分钟时完全消失。接下来，当 APAP 的剂量增加到 320mg/kg 时，近红外二区化学发光（NIR-II CL）的强度显著增加，最大信噪比达到 12.6，并且在 24 分钟时仍能微弱检测到。为了探究 NIR-II CL 成像相对于可见化学发光成像的优势，我们构建了一个对照探针 CL-540，其在 540nm 处发射最大化学发光强度。与 CL-P 成像相比，探针 CL-540 通过尾静脉注射在肺部有大量富集，导致肺部的信号比肝脏部位更明显。此外，可见化学发光信号在肝脏部位的强度最大信噪比为 5.6。因此，可以得出结论，由于组织中光子的吸收和散射较低，所报道的 CL-P 在 NIR-II CL 窗口中比可见化学发光窗口（CL-540）能够实现更高分辨率的成像。
与之前的一项研究36不同，在该研究中近红外二区荧光（NIR-II FL）信号始终处于 “开启” 状态且缺乏响应过程，而 CL - P 的近红外二区荧光信号在响应超氧阴离子之前几乎被阻断。与大多数已报道的双通道（化学发光/荧光，CL/FL）激活探针相比，CL-P是少数能够在近红外二区同时激活两个通道（CL/FL）的单分子探针之一。不同剂量下 CL - P 的近红外二区荧光信号随着反应的进行逐渐增强，然后达到峰值，这与近红外二区化学发光（NIR-II CL）信号的变化趋势相反。因此，在给予不同剂量的对乙酰氨基酚（APAP）处理后，在肝脏中也观察到了激活且逐渐增强的近红外二区荧光信号。在给予320mg/kgAPAP处理后，肝脏区域可检测到的近红外二区荧光信号变得更强，并在 32 分钟时达到最大值，与对照组相比增加了 3.1 倍。同样地，当在给予 CL - P 处理前给予一种肾保护性抗氧化剂 ——N - 乙酰 - L - 半胱氨酸（NAC，一种超氧阴离子清除剂）时，双重发光信号减弱至背景水平。更重要的是，肝脏部位的强度分布图表明，近红外二区化学发光成像具有更好的成像分辨率，其宽度适宜，为 17.6mm，信噪比是近红外二区荧光成像的 2.2 倍。
总结
我们基于 Schaap 二氧杂环丁烷，通过简单可行的合成路线，开发出了一类新型的直接近红外二区（NIR-II）化学发光单分子探针，其最大发射波长可达 1060 nm。通过共轭聚甲炔链，这些可激活的近红外二区化学发光发射体能够与原始的 Schaap 二氧杂环丁烷化学发光供体以及三种受体（二氰亚甲基 - 4H - 苯并吡喃（DCMO）及其衍生物二氰亚甲基 - 4H - 苯并噻吩并吡喃（DCMS）和二氰亚甲基 - 4H - 苯并硒吩并吡喃（DCMSe））成功偶联。响应后，这些激活的化学发光团能够产生明亮的近红外二区化学发光，并生成具有扩展 π 共轭的苯甲酸酯，其光致发光发射光谱与母体的化学发光光谱基本一致。同时，这种理想的近红外二区化学发光具有明显优势，包括特异性响应、持续发光、穿透深度深（1.2 厘米）以及高信噪比（43.5）。我们构建了一种双激活的近红外二区化学发光 / 荧光信号，用于检测对乙酰氨基酚诱导的肝损伤中的超氧阴离子，这使得在这个单分子成像平台上能够进行实时、连续的信号采集，并且证明了近红外二区化学发光成像比近红外二区荧光成像具有更高的灵敏度和分辨率。
参考文献
Molecular Engineering of Direct Activated NIR-II Chemiluminescence Platform for In Vivo Chemiluminescence-fluorescence Duplex Imaging ,Zhongxiang Chen, Qian Li, Ying Wu, Jianyong Liu, Luntao Liu , Lichao Su ,Rongrong Wu & Jibin Song, Nat. Commun| (2025) 16:238, https://doi.org/10.1038/s41467-024-55503-4
