内容提要
本研究引入了一种新型的余辉探针，该探针具有环丁烯核心结构，通过减少探针内核心反应位点的空间位阻来实现出色的对比度，并且具备余辉发光特性，以最大程度地降低自发荧光的影响。这种设计的主要目标是大幅提高余辉发光探针对单线态氧(1O2)的检测灵敏度和检测范围，尤其是在癌组织的弱酸性微环境中，从而有助于对模拟光动力疗法（PDT）过程中光敏剂产生的细胞内单线态氧(1O2)进行精确成像。该探针在缺氧和弱酸性条件下表现出的增强发光强度，也使其能够在小鼠腹膜模型中实现精细成像。
结果与讨论
由于双键上取代基的空间位阻效应，环张力和空间位阻会影响与单线态氧（1O2）的反应活性）。为了阐明探针结构与余辉发光成像特性之间的构效关系，我们设计并合成了一种新型余辉发光探针，其具有亚甲基环丁烷的高环张力核心结构）。我们还使用了环张力较低的亚甲基环己烷作为结构的探针2，以及含有庞大金刚烷基团的探针 3，作为对比参考探针。合成过程包括使环丁酮、环己酮和金刚烷酮与膦酸酯通过Wittig-Horner反应形成 E - 烯烃。在脱保护之后，通过氯化镁介导的羰基化反应引入醛基。随后，通过Wittig反应制备出了探针1、探针2和探针3。
在强度为5.4 毫瓦 / 平方厘米的白光下持续照射 60 秒后，探针1在中性 pH值7.4的条件下展现出了很强的余辉发光强度。探针1的半衰期仅为1分钟。在模拟肿瘤组织的弱酸性条件（pH = 6.6）下，探针 1 持续呈现出强烈的余辉发光，其半衰期延长到了令人瞩目的 11 分钟。在 IVIS 生物发光成像模式下，即使在一小时后，余辉信号仍然可检测到。这些发现突显了新开发的探针在肿瘤微环境特有的弱酸性环境中的显著优势，使其在长期检测和追踪单线态氧(1O2)方面具有更高的稳定性和效能。利用探针 1 独特的结构特性，定量分析显示，在弱酸性条件下，探针 1 的余辉强度分别比探针 2 和探针 3 高出 33 倍和 66 倍。与 SOCL 相比，探针 1 表现出更高的亮度，这有助于在体内实验中实现更好的组织穿透性，从而提升成像性能。在白光照射 60 秒后，在存在或不存在亚甲基蓝（MB）的相同条件下，收集并比较了探针 1、探针 2 和探针 3 的化学发光信号。基于测量和计算结果，探针 1、探针 2 和探针 3 的信噪比分别达到了 88、57 和 3.3。
我们对探针 1 的发射波长进行了评估，发现其余辉信号主要分布在 510-650 纳米范围内。这一光谱特性表明该探针具有相当不错的组织穿透能力。为了进一步探究探针 1 产生余辉的触发因素，我们研究了热量是否能引发余辉响应。结果显示，当探针 1 与亚甲基蓝（MB）结合的体系（探针 1 + MB）被加热到 40 摄氏度时，并未观察到明显的余辉发光现象。当探针 1 + MB 经过 LED 白炽灯照射 60 秒后，出现了强烈的余辉信号。这一结果表明，余辉信号的激发主要是由光引发的，而非由热引起的。探针 1 并非一次性消耗品，即使在经过七次 LED 光照后，它仍保留着检测强荧光信号的能力，且余辉信号强度仍超过初始水平的 60%。
我们发现探针 1 不仅在模拟肿瘤微环境的弱酸性条件下在余辉发光方面表现出色，而且还拥有显著延长的半衰期和更高的灵敏度。这些特性赋予了探针 1 在持续监测和追踪单线态氧(1O2)方面无与伦比的优势。值得注意的是，该探针的余辉信号主要是由光驱动产生的，而非热诱导，并且它支持重复光照成像，显示出了良好的循环稳定性。这些数据突显了探针 1 在体内检测单线态氧(1O2)方面的潜力和有效性，我们使用一只组织深度约为 1.5 厘米的活体小鼠，进一步探索了它的应用潜力。如图所示，在预光照后，收集了位于活体小鼠下方的探针 1 和亚甲基蓝（MB）产生的余辉和荧光发光信号。余辉信号清晰可见，而荧光信号几乎检测不到。此外，我们采用了一种创新的方法，在白光预光照后，将探针 1 和亚甲基蓝（MB）的混合物先皮下注射，随后注射到小鼠的后肢淋巴结中，以实现淋巴成像。这些实验表明，探针 1 产生的余辉发光信号很强，其信号背景比（SBR）明显高于荧光信号，展示了它出色的体内成像能力，从而突显了它在生物医学应用方面的巨大潜力。
为了验证该探针是否能够有效地对光动力治疗过程中产生的细胞内单线态氧(1O2)进行成像，我们设计了两组实验。如图所示，在探针 1 和亚甲基蓝（MB）共同孵育细胞的体系中加入单线态氧(1O2)的特异性猝灭剂 NaN₃后，余辉发光信号降低了 72%，这证实了探针 1 在细胞层面上对单线态氧(1O2)的特异性响应。此外，我们观察到，在用探针 1、亚甲基蓝（MB）或它们的组合孵育细胞后，未被 LED 光源激活的细胞没有任何发光信号。相比之下，在经过 3 分钟的 LED 白炽灯照射后，与探针 1 和亚甲基蓝（MB）共同培养的细胞表现出显著的余辉发光，而仅用探针 1 或亚甲基蓝（MB）处理的细胞则没有出现这种发光现象。基于探针 1 成像技术在精准定位细胞内单线态氧(1O2)方面取得的成功，我们旨在评估该探针对特定器官模型和活体小鼠中的单线态氧(1O2)进行可视化的潜力。在最初的实验阶段，我们选择了小鼠肝脏组织进行余辉发光成像。我们使用了 BALB/c 小鼠，并将过氧化氢(1O2)/ 钼酸钠(1O2)混合物注射到小鼠腹部区域。由此产生的单线态氧(1O2)原位生成，与探针 1 结合后，使小鼠腹部区域产生了明显的发光现象。当引入过氧化氢(1O2)/ 钼酸钠(1O2)/NaN₃后，发光信号大幅减弱。此外，加入探针 1 和 NaN₃并未产生任何可察觉的发光反应，这与对照组的反应类似。这些全面的研究进一步证实了探针 1 作为一种有效探针对活体小鼠体内单线态氧(1O2)进行实时可视化的地位。
总结
现有的单线态氧(1O2)探针在实时监测、灵敏度、选择性、稳定性以及避免自发荧光干扰等方面存在局限性。此外，它们固有的光敏特性可能会诱导额外的单线态氧(1O2)产生，从而影响检测的准确性。为了应对这些挑战，我们开发了一种新型的余辉探针，其采用了亚甲基环丁烷的设计，减少了空间位阻，使得该探针在与单线态氧(1O2)发生反应时能够快速释放能量，并产生强烈的余辉发光。 与先前报道的用于检测单线态氧(1O2)的探针不同，新开发的探针 1 降低了分子内核心反应位点的空间位阻，在与单线态氧(1O2)形成高能过氧化物后能够快速释放能量。这一策略有效地实现了对单线态氧(1O2)的高性能检测，并提供了极其广泛的检测范围。它能够对光敏剂产生的微量单线态氧(1O2)进行成像，并且在肿瘤微环境中能够显著发光。
参考文献
Long-Term and Highly Sensitive Detection of Singlet Oxygen In Vivo With A Single Methylenecyclobutane Afterglow Probe,Yun Zhang,Yu-Ting He, Xuan He,Silin Huang*,and Xue-Qiang Wang,CCS Chem. 2024,DOI: 10.31635/ccschem.025.202505498
