内容提要
细菌感染是威胁人类健康的许多严重炎症疾病的主要原因。现有的细菌感染的治疗方案总是复杂和不令人满意。人们对开发一种更有效的治疗感染的方法越来越感兴趣。在此，作者报道了一种含有鲁米诺、AIE染料(TTDC)、pcpdbt和一氧化氮(BNN6)的近红外(NIR)化学发光(CL)纳米ALPBs的发展，它可以实现深CL成像引导的光热-NO气体治疗细菌感染。经静脉注射后，ALPBs可大量积聚在感染部位，并被过量分泌的活性氧(ROS)激活，产生近红外化学发光，可精确追踪感染引起的局部炎症。在影像学指导下，进一步采用808 nm激光辐照进行光热- NO协同治疗，有效根除细菌，感染组织迅速恢复。ALPBs的应用为对抗细菌感染提供了一个强大的、可控的“一体化”平台。
结果与讨论
ALPBs的合成与表征
设计了无水铃木反应和硅胶催化无溶剂酮-丙二腈缩合的一锅串联反应，以工业反应物为原料，以>85%的收率快速合成TTDC。合成路线和结构鉴定结果如所示。
此外，由于施受体结构，TTDC的吸收和发射最大值分别在460 nm和680 nm处，可以精确匹配鲁米诺的CL发射和PCPDTBT的最大吸收，从而保证了通过TTDC从鲁米诺到PCPDTBT的高效能量传递。TTDC在纯DMSO中表现出微弱的发射。在DMSO溶液中加入水后，TTDC发射可以显著增强，在680 nm处达到最大值，显示出aie活性。在此基础上，采用双乳液法制备了ALPBs, TEM观察到ALPBs形貌均匀，呈球形。采用同样的方法，合成了ALPs(含TTDC、鲁米诺和PCPDTBT的纳米颗粒)和ALs(含TTDC和鲁米诺的纳米颗粒)作为对照纳米颗粒。动态光散射(DLS)结果显示，alpb的平均直径在200 nm左右，与TEM图像一致。ALs和ALPs的大小也与ALPBs相似。通过HPLC和UV-vis光谱分析，计算出ALPBs中鲁米诺、TTDC、PCPDTCT和BNN6的负载含量分别为3.10%、0.66%、2.10%和3.40%。在急性感染的组织中，中性粒细胞可以被迅速动员和积累，在炎症信号激活后可以产生大量的H2O2和ClO−。因此，在模拟炎症条件下评估ALPBs的CL特性。与H2O2/ClO−孵育后，ALs显示出可见的红色发光，其光谱形状与TTDC的荧光光谱几乎相同。重要的是，当将pcpdbt引入纳米颗粒中时，ALPBs的CL光谱可以进一步向近红外区红移，并在810 nm处出现峰值，显示出高效的CRET。其次，检测ALPBs的CL信号的时间过程。H2O2溶液中ALPBs的CL信号比ClO−溶液中ALPBs的CL信号更强，持续时间在1.5 h以上。相比之下，H2O2/ClO−可以大大提高CL信号强度，在CL检测后10 min, CL信号强度几乎是H2O2的6.5倍，表明H2O2/ClO−加速了luminol的氧化，这与前人的研究结果一致。此外，ALPBs还可以快速响应各种活性物质，如超氧阴离子(O2•-)、羟基自由基(•OH)和过氧亚硝酸盐(ONOO−)，在炎症条件下显示出良好的成像潜力。此外，在808 nm激光照射(1.0 W/cm2)下，ALPBs的温度从26.0迅速上升到46.7◦C，而在相同的激光照射条件下，水溶液的温度仅从24.6轻微变化到24.9◦C，显示出其良好的光热转换效率。
为了验证ALPBs的NO释放是否可控，采用DAF-FM(商用NO探针)监测NO释放动力学。在808 nm激光刺激下，DAF-FM的荧光强度逐渐增强，是未照射组的6倍，表明ALPBs中有明显的NO释放。通过体外模拟实验，评价了ALPBs的组织穿透能力。本例中，在H2O2/ClO−孵育后，分别用不同厚度的小鼠组织覆盖鲁米诺、ALs和ALPBs溶液，并立即通过IVIS活体成像系统进行检测。ALPBs的穿透深度比单独使用鲁米诺至少高2.5倍，比ALs高1.6倍，表明ALPBs的近红外CL有利于深部组织成像，具有高灵敏度和高穿透性。
ALPBs的体外抗菌治疗
随后进行体外抗菌实验，评估ALPBs的治疗效果。含有致密细胞外基质结构的生物膜是抗菌治疗的另一个障碍，因为它们可以保护内部微生物免受抗菌药物和宿主免疫细胞的攻击。因此，作者试图探索ALPBs是否可以通过细胞渗透和抗菌能力来破坏生物膜，从而根除隐藏的细菌。为此，建立金黄色葡萄球菌生物膜模型，动态监测ALPBs的渗透和积累。用ALPBs处理后，用共聚焦显微镜对生物膜进行成像。共聚焦图像和定量荧光结果显示，随着时间的推移，ALPBs可以快速扩散并积聚到金黄色葡萄球菌生物膜中，并在30分钟内达到最大值。此外，还通过各种方法进一步研究了ALPBs的协同治疗效果。首先采用结晶紫染色法评价生物膜生物量的变化。与未处理组相似，单独使用ALPs、ALPBs或激光处理的生物膜呈现深紫色，表明这些处理对生物膜的毒性可以忽略不计。而经过激光照射后，ALPs和激光处理的生物膜的颜色变浅。ALPBs +激光组紫色进一步降低。定量结果还显示，ALPBs +激光组生物膜的生物量明显低于其他对照组，表明抗生物膜治疗效果明显。此外，通过金黄色葡萄球菌WHGFP生物膜的PI染色，评价了不同处理的协同抗生物膜能力。在本实验中，正常GFP转基因细菌发出绿色荧光，而细胞膜受损的细菌发出红色荧光。与未处理组相比，ALPs +激光处理的生物膜有少量的红色荧光点，表明对生物膜的PTT有效。ALPBs +激光组红色荧光密度进一步升高，可见光活化PPT与NO治疗的协同作用。另一方面，分别与ALPs和ALPBs孵育后，金黄色葡萄球菌在溶液中的细菌活力受到的影响可以忽略不计，表明具有良好的生物相容性。然而，通过激光照射，ALPBs和ALPBs均对金黄色葡萄球菌产生明显的细胞毒性，而ALPBs的杀菌能力优于ALPBs，提示ALPBs具有良好的协同光热- NO疗法，可以消融自由活菌。综上所述，这些体外实验证明了ALPBs在治疗细菌相关感染方面的巨大潜力。
ALPBs对细菌感染的体内CL成像
由于ALPBs在体外抗菌实验中的优异表现，进一步评估了其在体内的应用。健康小鼠经静脉注射ALPBs后，血液中ALPBs的荧光信号随时间迅速下降，注射后第2天达到10%以下，表明机体清除迅速。此外，注射后7天内，血液生化指标与正常小鼠无明显变化，进一步证明了其体内安全性。采用小鼠后肢肌内注射金黄色葡萄球菌WHGFP建立细菌感染小鼠模型。12 h后，将ALPBs静脉注射到小鼠体内。然后，立即用IVIS活体成像系统监测ALPBs给药小鼠。小鼠后肢的荧光信号随着时间的推移逐渐增加，并在静脉注射ALPBs后5小时达到最大值，这表明由于炎症诱导的血管渗漏，纳米颗粒在感染组织内优先积累。相比之下，来自同一区域的CL信号可以持续约5小时，并在i后3小时最强烈。
给药ALPBs，表现出良好的ALPBs炎症成像性能。然后处死小鼠，解剖不同脏器进行离体成像。通过荧光成像，感染组织和网状内皮系统(RES)器官如肝脏表现出强烈的信号。相比之下，感染组织的CL信号在不同器官之间具有极高的特异性。定量结果显示，感染组织的相对CL强度比对侧正常肌肉组织至少高10.3倍，比其他所有组织至少高6.6倍。感染组织切片共聚焦图像显示，被侵染细菌周围散布红点，表明具有良好的组织穿透性和细菌靶向效果。此外，腹腔注射ALPBs也可以监测腹腔细菌感染，显示了ALPBs的深层组织成像能力。综上所述，这些结果阐明了ALPBs可以被感染组织中过量的ROS特异性激活，但在所有其他正常器官中保持稳定。
体内协同光热- NO -治疗细菌感染
最后，评估了通过协同光热- NO疗法是否可以根除入侵细菌。细菌感染小鼠分别接受ALPs、ALPBs和ALPs/激光治疗作为对照组。实验组在CL显像指导下，于注射ALPBs后5 h，对小鼠感染位点进行808 nm激光照射。通过热成像仪监测小鼠的体温变化。激光治疗7 min后，感染组织的温度从35.6℃显著升高到47.0℃，而盐水加激光治疗小鼠的温度仅略有升高，说明该治疗具有明显的光热效应。
进一步分析了ALPBs光致细胞毒性的抗菌作用。1天后，切除感染的肌肉组织进行CFU测量。阿尔卑斯山/激光组小鼠金黄色葡萄球菌感染组织的CFU低于其他对照组。重要的是，ALPBs/激光治疗进一步显著降低了感染组织的CFU。此外，ALPBs具有与大肠杆菌相似的体内抗菌活性。这些结果表明ALPBs对细菌具有明显的协同抑制作用。并于处理后第7天收集组织消化解离后的细胞悬液进行流式细胞术分析。经定量分析，在金黄色葡萄球菌感染的协同治疗中，中性粒细胞浸润百分比约为16.7%，明显低于其他所有对照组。H&E图像还显示，与未治疗组相比，经ALPBs/激光治疗的金黄色葡萄球菌或大肠杆菌感染的肌肉表现出罕见的炎症细胞浸润(蓝点)和更好的组织形态，表明协同抗菌治疗具有良好的炎症抑制和组织恢复潜力。
结论
总之，作者开发了一种多功能自发光纳米探针，用于同时进行炎症成像和深部组织感染的抗菌治疗。通过双乳化法，将鲁米诺、TTDC、pcpdbt和BNN6共包封在PLGA-PEG5000中，制备ALPBs。采用一锅串联反应巧妙地合成了TTDC，具有典型的AIE特性。
更重要的是，TTDC的紫外吸收光谱和荧光发射光谱能够与鲁米诺和PCPDTCT精确匹配，保证了有效的CRET工艺。体内实验结果表明，ALPBs中的鲁米诺可与过量分泌的ROS反应产生蓝色发光，蓝色发光可通过TTDC进一步激发附近的pcpdbt，通过CRET产生穿透组织的近红外CL。此外，在CL信号的引导下，808 nm激光照射下，ALPBs可进行PTT，进一步激活热敏NO供体BNN6，产生足够的NO分子，对细菌感染肌肉组织的协同治疗效果优异。这是首次实现深部组织感染的CL和光热- NO同时治疗，为更有效的抗菌治疗提供了一种新的治疗方法。由于这些独特的优势，预计开发的纳米颗粒将在临床环境中治疗细菌相关疾病方面具有很高的潜力。
参考文献
Near-infrared chemiluminescent nanoprobes for deep imaging and synergistic photothermal-nitric-oxide therapy of bacterial infection.Yuping Zhou, Wenbo Wu, Pengxiang Yang, Duo Mao, Bin Liu, Biomaterials, 288, 2022, 121693.https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2022.121693.
