内容提要
本文通过激发态电荷转移动力学变化率（δ）作为荧光“开启”的关键决定因素，设计了一系列的AFPs及其非笼化的AFPs（uAFPs），并系统地分析了它们的物理特性和响应性，包括理论计算，飞秒瞬态吸收光谱，稳态荧光光谱和荧光滴定实验验证了理论和实验δ值与活化AFP的荧光“开启”比率之间的强相关性。最佳探针AFP 2（δ）可用于药物性肝损伤的早期诊断和微小转移灶（<2 mm）的超灵敏检测这项研究强调了δ作为探针反应性预测因子的潜力，它可以简化和加速NIR-II AFP的开发和优化，实现更广泛的临床前和翻译应用。
可激活的NIR-II荧光探针中ESCT动力学分析
为了构建可活化的NIR-II荧光探针，设计了苯酚连接的噻吩缀合的苯并噻唑衍生物荧光团支架，其在苯酚的对位上具有苯磺酸酯基团作为H2S响应性荧光猝灭部分。通过在噻吩上引入具有不同烷基链长度的3 '或4'取代基，制备了一系列AFP获得了具有不同构象的AFP 1、AFP 2和AFP 3以及它们的未包裹的对应物uAFPs（uAFP1，uAFP2，uAFP3）。我们进行了DFT和TD-DFT计算分析，以研究气体中AFP和uAFP之间的ESCT动力学变化。使用参数δC定量每个AFP/uAFP对之间的电荷转移（CT）特性的变化，定义为第一激发态中的CT比变化。结果证实了AFP和uAFP两者的发射在第一激发态中存在CT特征。在探针对中，代表AFP 2/uAFP 2之间CT特征变化比率的δC-2具有最大的变异（0.18），其次是AFP 1/uAFP 1之间的δC-1（0.15）和AFP 3/uAFP 3之间的δC-3（0.05），表明AFP 2和uAFP 2探针对表现出最显著的ESCT动力学变化。我们还计算了AFP/uAFP对在水溶液中CT特征的变化，用参数δCH表示。同样，δCH-2表现出最大的变化（0.16），其次是δCH-1（0.13）和δCH-3（0.06），与气相的相同趋势一致，增强了δ作为不同环境中比较描述符的可靠性。
接下来，我们合成了AFP和uAFP，并对其物理性质进行了评价，采用纳米沉淀将这些AFP和uAFP转化为水-具有两亲性三嵌段共聚物的可溶性纳米颗粒（PEG-b-PPG-b-PEG）。我们接下来检查了稳态荧光光谱以评估AFP和uAFP的荧光强度。（QY = 0.5%，在DCE中）作为参比荧光团，uAFP 1、uAFP 2和uAFP 3在甲苯中的QY分别为4.39%、4.11%和3.37，从AFP 1到uAFP 1，荧光强度增加了7.68倍，从AFP 2到uAFP 2，荧光强度增加了17.54倍，而AFP 3和uAFP 3均显示出负荧光强度，其保持不变。这些结果表明，尽管uAFP 1在uAFPs中显示出最高的亮度，AFP 1相对较高的初始背景荧光导致较低的荧光强度变化率与AFP 2/uAFP 2相比，结果，AFP 2/uAFP 2在这些探针对中显示出最显著的荧光强度变化率。
甲胎蛋白对H2S的体外光响应变化
为了评估AFP 2是否在AFPs中表现出对H2S的最佳响应能力，我们检查了AFP 1、AFP 2和AFP 3在存在和不存在NaHS的情况下的体外光学性质（H2S发生器）AFP 1、AFP 2和AFP 3在634、630和724 nm处显示特征吸收峰在与H2S孵育后，所有AFP的吸收峰逐渐红移至692、680和796 nm。（900 - 1300 nm）最初被“关在笼子里”，由于H_2S ~-抑制了酚基的给电子能力，响应于H2S的这些AFP的吸收和荧光特征与其未包裹的衍生物的吸收和荧光特征密切匹配（uAFP 1、uAFP 2和uAFP 3），进一步证实AFP对H2S的成功应答。AFP 1和AFP 2的近红外荧光强度分别增加了4.91倍和11.87倍，在四氢呋喃/水和H2S的混合溶剂中，AFP 1和AFP 2的近红外荧光强度分别增加了6.94倍和14.29倍，与纳米探针的趋势一致值得注意的是，虽然在与H2S孵育后，AFP 1显示出比AFP 2更高的NIR-II荧光强度，但其荧光增强低于AFP 2。这归因于AFP 1扭曲的骨架，这降低了其电荷转移能力，并导致较高的初始荧光背景，表明“始终开启”NIR-II荧光探针的设计策略不太适合于可活化的NIR-II荧光探针。AFP 3响应于H2S的荧光降低是由于其平面构型，这导致在与H2S相互作用后荧光淬灭，导致荧光信号降低。由于其上级响应能力，AFP 2被选择用于随后的体外和体内生物成像应用。利用MALDI-TOF质谱分析了AFP 2在H2S作用下的结构变化，在m/z = 766.26 [M + H]+处出现一个峰，对应于uAFP 2，证实了AFP 2在H2S作用下转变为发色团uAFP 2，AFP 2的NIR-II荧光强度在0 - 240 μM的H2S浓度范围内表现出强线性相关性，包括生理和病理相关水平的H2S。AFP 2的检测限（LOD）被确定为0.075 μM（75 nM）。此外，AFP 2表现出响应H2S的快速荧光激活，在15 min内达到信号饱和在连续激光照射60分钟下，AFP 2在响应H2S后表现出NIR-II荧光强度的最小变化，表明其具有高的光稳定性。AFP 2的荧光强度在潜在的干扰物质存在下几乎保持不变，包括其他活性硫物质（RSS）、活性氧物质（ROS）、活性氮物质（RNS）和金属离子与其他报道的NIR-II可激活的荧光探针的比较分析显示，AFP 2在LOD和稳定性方面优于大多数NIR-II可激活的荧光探针这些结果证明AFP 2是用于以高灵敏度和特异性检测H2S的有效的可活化的NIR-II荧光探针。
药物性肝损伤的实时NIR-II荧光成像
为了能够早期诊断DILI，两亲性三嵌段共聚物（PEG-b-PPG-b-PEG）与肝细胞靶向配体N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）连接，并与探针共沉淀，得到靶向纳米探针AFP 2G及其未包裹的衍生物uAFP 2G。一种在肝细胞中特异性表达的内吞受体。29使用1H NMR和FTIR证实了PEG-b-PPGb-PEG和GalNAc通过缩合反应的成功缀合。所得纳米探针AFP 2G和uAFP 2G表现出与AFP 2和uAFP 2相似的尺寸分布和球形形态。纳米颗粒尺寸保持稳定，在含有10%胎牛血清（FBS）的PBS中储存2周后没有显著变化表明稳定性极佳。在确定了纳米探针的生物相容性后，在提取自雌性C57 BL/6小鼠的原代肝细胞中检测了AFP 2G的肝细胞靶向能力原代肝细胞包括实质细胞。（肝细胞）和具有一个核的非实质细胞（NPC），细胞核染色和激光共聚焦显微镜观察。由于未固定探针（uAFP 2G和uAFP 2）均为内源性荧光蛋白，体外和体内荧光成像技术评价了它们的肝细胞靶向性，从与uAFP 2G孵育的肝细胞中检测到强荧光信号，而uAFP 2-孵育的原代肝细胞中的荧光信号主要观察到来自NPC计算uAFP 2G-和uAFP 2-孵育的原代肝细胞的肝细胞的相对平均荧光强度（MFI）（MFIh）和NPC的MFI/MFIN。uAFP 2G孵育的细胞中的MFIh/MFIN（33.26倍）是uAFP 2孵育的细胞中的MFIh/MFIN（0.43倍）的77.32倍，证明了AFP 2G的优异的肝细胞靶向能力。在ASGPR过表达的HepG 2细胞中，与uAFP 2相比，uAFP 2G的更高的细胞摄取进一步证实了AFP 2G的高靶向效率。
实时NIR-II荧光成像引导的癌症手术
在临床上，外科医生必须在癌症手术中完全切除所有肿瘤组织并清楚区分肿瘤和正常组织的边界。然而，由于当前检测方法的灵敏度有限，检测微小肿瘤，尤其是直径小于2 mm的转移性肿瘤仍然具有挑战性。32为了解决这一问题，建立了腹膜癌病CT 26荷瘤小鼠模型，以评估AFP 2用于实时成像引导癌症手术的可行性，J2 S在CT 26结肠肿瘤中选择性上调，在该模型中，各种大小的肿瘤结节分布在腹膜腔中。AFP_2能有效地描绘肿瘤，其肿瘤/正常组织（T/N）比值在注射后8 - 48 h内保持恒定约为6.51，允许精确的NIR-II荧光成像引导手术。基于此，选择注射后36 h为最佳手术切除时间窗，由南京鼓楼医院外科医生在近红外荧光成像引导下进行肿瘤手术（中国南京）。最初，外科医生在没有影像学引导的情况下，完全依靠经验进行了第一次肿瘤切除手术。在这次无引导手术中，直径大于2 mm的肿瘤被成功切除然而，在第一次手术后，AFP 2使能的NIR-II荧光成像识别出腹膜腔中肉眼不可见的微小残留肿瘤，大部分直径小于2 mm这些微小残留肿瘤的T/N比均高于6.74，反映了AFP 2对CT 26肿瘤中上调的H2S的高敏感性。然后，外科医生在NIR-II荧光引导下进行第二次手术，去除残留的肿瘤，直至检测不到进一步的NIR-II荧光信号切除的肿瘤结节的组织学染色证实NIR-II荧光成像精确地识别了正常组织和肿瘤组织之间的边界，导致在第二次手术切除的组织中只有少量的正常结缔组织。相反，第一次手术切除的肿瘤组织含有大量的正常组织这些结果证实AFP 2是高度响应的可激活的NIR-II荧光探针，为癌症检测提供了卓越的灵敏度，并帮助外科医生在癌症手术期间进行更准确的肿瘤切除。
总结
完全释放可激活的NIR-II荧光探针用于生物成像的潜力的主要挑战在于有效地优化其响应于生物标志物的信号“开启”比率。在腹膜转移的成像引导手术导航模型中，AFP 2能够超灵敏地检测T/N比超过6.74的微小肿瘤病灶（<2 mm），这些发现表明，AFP 2以其显著的灵敏度和特异性，是一种理想的可激活的近红外光谱，II荧光探针用于体内H2S检测，证实δ是探针响应性能的可靠指标。据我们所知，这项研究是第一个报告δ作为可激活的NIR-II探针的荧光“开启”比率的预测因子。
参考文献
Tuning Second Near-Infrared Fluorescence Activation by Regulating the Excited-State Charge Transfer Dynamics Change Ratio,Linrong Chen,Meitang Peng, Yanni Ouyang, Jian Chen, Haoze Li, Min Wu, Rui Qu, Wenya Zhou, Chunfeng Zhang, Yuyan Jiang,* Shidang Xu,* Wei Wu, Xiqun Jiang,* and Xu Zhen,J. Am. Chem. Soc. 2025, 147, 17330−17341,https://doi.org/10.1021/jacs.5c03763
