内容提要
基于 DPM-HD3 的双重性质多模态特性，我们构建了一种CO激活型多模态发光剂 DPM-HD3-CO，用于荷瘤小鼠的分步成像引导治疗。DPM-HD3-CO 能够克服肿瘤异质性的干扰，并通过多模态成像揭示不同治疗阶段中CO水平与治疗反应之间的关系。双重性质多模态发光剂概念的引入将为染料化学开辟一条创新途径，为其在化学、生物医学成像和能源等领域的未来广泛应用提供更大的可能性。
具有ACQ/AIE 双重性质的多模态发光剂合成与光物理性质研究
我们以半花菁染料（HD）为骨架构建了近红外-Ⅱ DPMs。一方面，扩大HD的共轭骨架将产生具有长波长的染料（ACQ-HD）ACQ-HD染料具有大的D-A共轭刚性结构，在溶液中潜在地表现出良好的荧光性质，同时在聚集状态下对ACQ现象敏感。另一方面，扭曲基团的引入可以将HD染料转化为具有AIE特性的染料（AIE-HD）。AIE-HD在聚集状态下将具有高荧光信号，而在溶液状态下，由于高分子内振动或旋转，非辐射跃迁可能占主导地位（强光热和PA效率）。通过在分子和形态学水平上操纵用于扭曲基团和刚性平面的分子策略，我们可以设计一系列双态多峰染料（DPM-HD 1 -3）通过将ACQ-HD和AIE-HD染料的优点结合到单个分子中，具有NIR-II FL、PA和光热性能。基于DPMgens的双性能多峰特性，我们计划设计一种可激活的治疗诊断剂DPM-HD 3，用于分步成像引导的癌症异质性精确治疗。双态多模式探针可以克服复杂肿瘤微环境中的非均匀聚集效应，显示出高保真的双态多模式发光特性，从而为癌症的精确检测和个性化治疗提供了有前途的工具。
我们使用UV-Vis-NIR吸收光谱和荧光光谱研究了AIE-HD、ACQ-HD和DPM-HD 1 -3在各种溶剂中的物理性质在溶剂二氯甲烷（DCM）中，AIE-HD、ACQ-HD和DPMHD 1 -3表现出位于701/808的最大吸收/发射波长，值得注意的是，DPM-HD 3在EtOH中的吸收/发射波长可以扩展到900/950 nm。与已合成的近红外半菁染料HD相比，DPM-HD 3的最大发射波长红移了230 nm以上，说明增强ICT效应和刚性共轭结构可以同时扩展吸收和发射波长。ACQ-HD在稀溶液中显示出稳健的NIR-II FL效率，荧光量子产率（ΦF）为0.404%。相反，ACQ-HD的荧光信号在固态下明显猝灭，可能是由于分子间的π-π堆积引起的聚集诱导猝灭效应，而AIE-HD的荧光发射效率较低（ΦF为0.048%），而在固态下显示出更高的荧光发射（915 nm（ΦF = 0.105%），可能是由于聚集诱导的发射效应。为了比较AIE-HD和ACQ-HD分子在其聚集状态下的物理性质，当水含量（fw）从0%增加到40%时，ACQ-HD的FL 923信号逐渐增强，这可能是由于溶剂极性增强。当fw超过40%时，FL 923信号显著降低直到其达到基线，这可能是由于ACQ效应和/或聚集体形成期间溶解度的降低AIE-HD的FL 815信号随着fw的增加（0-60%）而逐渐增强，这可能归因于AIE效应。当fw超过70%时，FL 815信号逐渐减弱，可能是由于较高含水率下的分子沉积所致;此外，我们进一步测试了不同含水率下ACQ-HD和AIEHD的吸收光谱，ACQ-HD的吸收在fw超过40%时开始下降，而AIE-HD仅在fw超过60%时才开始下降，表明它们的吸收减少也与高水含量下的荧光猝灭有关。（fw = 70%），AIE-HD和ACQ-HD的荧光寿命分别为1.195 ns和6.986 ns，分别计算的声学响度因子（ALF）分别为3.35 × 1013和3.04 × 1012，这些结果表明ACQ-HD和AIE-HD仅在单一状态下表现出有效发射在实践中，这种单态发射特性增加了成像的不确定性，因为发光材料通常在复杂的生物环境中聚集到不同程度。在乙醇溶液中，DPM-HD 1 - 3分别在908、920、950 nm处显示出良好的近红外荧光发射，表明扩大共轭和增强ICT效应有助于延长染料的发射波长。此外，与AIE-HD相比，（ΦF = 0.048%），DPM-HD 1 -3表现出较高的荧光发光效率，ΦF为0.38%，这些发现表明，DPM-HD 1-HD 3的刚性缀合主链的分子量为0.25%至0.28%。3分子在液体状态下促进发光。表明AIE-HD、ACQ-HD和DPM-HD 1 -3表现出优异的光稳定性，这可能有利于长期成像。DPM-HD 13在1115，1020，1045 nm。DPM-HD2（ΦF = 0.067%）和DPM-HD 3（ΦF = 0.072%）都表现出比DPM-HD 1更高的固态FL效率（ΦF = 0.026%），这可能是由于存在较大的空间位阻基团在DPMHD 2和DPM-HD 3中的热塑性弹性体（TPE和TPA），这可以减少面对面的π-π堆叠，从而增强固态发光。DPM-HD 1 -3的固态发射与其液态相比显示出约100 nm的红移，可能是由于准分子的存在，固体状态下DPM-HD 1 -3的荧光寿命较长比溶液状态高（2-8倍），在不同温度下的固态荧光光谱表明，DPM-HD 1- 3对固态温度变化不太敏感。
通过测量AIE-HD、ACQ-HD和DPM-HD 1 - 3在不同波长下的光致发光强度，记录了它们的光致发光光谱，结果表明光致发光光谱与吸收曲线之间有很好的相关性，说明光致发光信号来源于近红外发色团的吸收在50%PBS/EtOH溶液中，AIE-HD和DPM-HD 1 -3表现出比ACQ-HD更高的PA强度，PA强度顺序为ACQ-HD < AIE-HD <DPM-HD 1 <DPMHD 2 <DPM-HD 3。AIE-HD和DPMHD 1 -3分子中存在的PA基团（如DPA、TPE和TPA基团），其可以诱导适当的分子内运动，从而增强溶液中的PA信号。DPM-HD 1 -3的PA强度与其摩尔浓度呈良好的线性关系这些结果表明DPM-HD 1 -3在单分散状态下显示出NIR-II FL和PA的优异双峰性能。在近红外光照射下，AIE-HD、ACQ-HD和DPM-HD 1 -3溶液的最高温度分别为41.0、49.3、66.8、57.6和62.7 °C光热转换效率（η）分别为35.6、42.2、69.0、58.5、58.0、5.5、5.0、和65.3%，值得注意的是，DPM-HD 3的光热转换效率（PCE）比ACQ-HD高23.1%，表明增强的分子内运动有助于协调染料在液态下的非辐射跃迁过程。为了评估DPM-HD 1 -3的光热稳定性，我们记录了DPM-HD 1中的温度变化，实验结果表明，在808 nm的激光照射下，DPM-HD 1 -3经过4次加热-冷却循环后，其最高温度没有明显降低（1 W/cm 2）激光，而ICG的最大值（一种商业吲哚菁绿色染料）显著降低这些结果表明，DPM-HD 1 -3表现出优异的光热稳定性，这有利于实现延长的成像和光热治疗。DPMHD 1 -3在溶液状态和聚集状态下均表现出良好的声学响度因子（ALF（补充表2），这对于异构环境中的PA成像应用是有利的。我们研究了DPM-HD 1 -3在不同粘度下的PA性质。DPM-HD 1 -3分子的PA随着N，N-二甲基甲酰胺（DMF）-甘油混合物中甘油含量的增加而增加。此外，其吸光度和荧光发射也随着粘度的增加而逐渐增加。这一现象可能归因于在高粘度条件下DPM-HD 1 -3的共轭刚性平面增强，这增加了摩尔吸光系数并促进PA和FL信号的输出。
基于DPMgens的活性多模式治疗诊断剂的设计和光谱研究
内源性一氧化碳水平的异常与癌症的发展过程密切相关，因此，在不同治疗阶段对一氧化碳水平与治疗反应之间的关系进行时空动态监测对于诊断、利用DPM-HD 3独特的双重性质多模态发光特性，我们构建了CO激活的多模态治疗诊断剂，DPM-HD 3-CO，用于肿瘤异质性的阶梯成像引导治疗治疗诊断剂DPM-HD 3-CO使用氯甲酸烯丙酯官能化的氯甲酸烯丙酯，HD 3染料作为CO传感部分，PdCl 2作为捕获CO的添加剂。DPM-HD 3-CO的传感机制依赖于CO将Pd 2+转化为Pd 0，然后引发Tsuji-Trost反应以除去烯丙基。试剂DPMHD 3-CO最初不会显示NIR-II FL/PA/PTT信号，因为染料DPM-HD 3处于笼状状态。（DPM-HD 3CO + PdCl 2）特异性地响应于肿瘤相关的CO，DPM-HD 3将被释放，从而开启NIR-II FL，比率-PA，NIR-II FLI可快速定位肿瘤部位，PA成像可提供详细信息，如肿瘤的三维几何形状和深度，为个性化治疗提供清晰的指导。PTI可为光疗反应提供灵敏、快速的反馈，更重要的是，DPM-HD 3-CO可克服异质性疾病环境中的异质性积累效应，提供高保真的多模式诊断信息。因此，开发的可活化多模式治疗诊断剂DPM-HD 3-CO有望在不同治疗阶段的病理背景下解读肿瘤信息，及时调整肿瘤治疗方案，提高肿瘤治疗的精准度。
为了研究DPM-HD 3-CO用于近红外荧光/比功率放大传感CO的可行性，我们在体外研究了DPM-HD 3-CO探针的光学性质和靶向识别能力。首先，在PdCl 2存在下测试了DPM-HD 3-CO探针对CO的响应。游离的DPM-HD 3-CO表现出690 nm的最大吸收波长。当CORM-3浓度为100 μ M时，吸光度比Abs 900/Abs 690从0.02增加到2.39，表明DPM-HD 3-CO可用于CO的比率检测，时间依赖性研究发现，随着时间的延长，Abs 900的强度逐渐增加，在25 min时达到平台，表明探针DPM-HD 3-CO具有快速检测CO的能力。此外，我们还研究了DPM-HD_3-CO的光放大性能，在680 - 1064 nm波长范围内测量了DPM-HD_3 CO与CORM反应前后的光放大光谱。游离的DPM-HD_3-CO在690 nm（PA 690）处显示出较强的PA信号，而在900 nm处PA信号很弱（PA 900/PA 690 ~ 0.11）。与CORM-3反应后，PA 900信号显著增加，而PA 690信号降低，导致PA 900/PA 690信号增强约24倍。当用不同浓度的CORM-3处理DPM-HD 3-CO时，观察到PA 900/PA 690信号的剂量依赖性增强。
PA 900/PA 690与CORM-3浓度在0-30 μM范围内呈良好的线性关系，检测限为8.2 × 10−7 M，表明DPM-HD 3-CO具有优异的PA比。在与各种浓度的CORM-3孵育后，950（FL 950）处的NIR-II荧光强度增加了约26.7倍并证明与CORM-3浓度（0-40 μM）呈正线性关系，检测限为4.7 × 10−7M这些结果表明，探针DPM-HD 3CO在近红外-Ⅱ FL和PA双模式下对CO都表现出灵敏的响应。高分辨质谱（HRMS）和液相色谱-质谱（LC-MS）JRMS分析揭示在探针与CORM-3之间的反应之后在m/z 829.3846处存在明显的质谱峰，其对应于[DPM-HD 3]染料的分子量。
此外，LC-MS结果显示在保留时间19.17 min处存在m/z 829.3606的主离子峰，其与预期的化合物DPM-HD 3匹配（[M]+，计算的m/z 829.3636）dm/z 913.3819的离子峰归因于探针DPM-HD 3-CO这些结果证明探针DPMHD 3-CO可以在生理条件下与CO反应以释放染料DPM-HD 3，从而激活NIR-II FL 950和PA 900/PA 690信号。我们研究了DPM-HD 3-CO的选择性，结果表明，只有CO表现出明显的Abs 900信号增强，而其他分析物的吸收变化几乎可以忽略不计。我们还进一步检查了探针在不同浓度的ONOO存在下的化学稳定性。在100 μM ONOO-浓度下，CO结构可能部分受损，在存在或不存在15 μM ONOO的情况下，用15 μM CORM 3处理的探针的Abs 900值相似，表明探针DPM-HD 3-CO对CORM-3具有选择性响应。
癌细胞中活化治疗诊断剂的成像和光热治疗的评估
为了研究DPM-HD 3-CO对细胞内CO的反应，对肝癌细胞（Hepa 1 -6）和正常肝细胞（HL-7702）进行FL和PA成像，在细胞成像之前，使用细胞计数试剂盒（CCK-8）方法评估DPM-HD 3-CO对Hepa 1 -6和HL-7702细胞系的细胞毒性。在与DPM-HD 3-CO（50 μM）孵育24 h后，两种细胞系的存活率仍高于82，表明探针DPM-HD 3-CO对正常细胞和癌细胞都具有低毒性。探针DPMHD 3的能力-先前的研究表明，癌细胞比正常细胞释放更多的内源性CO 47。78时，HL-7702细胞的FL 950信号强度和PA 900/PA 690比值明显高于Hepa 1 - 6细胞，提示癌细胞内CO水平可能高于正常细胞（ZnPP，一种典型的内源性CO清除剂）作用1h后，FL 950和PA 900/PA 690比值信号显著降低。这些结果进一步表明，DPM-HD 3-CO可以选择性地识别癌细胞中增加的CO水平，为了进一步验证DPM-HD 3-CO可以有效地鉴定癌细胞中的CO水平，我们使用了商业CO探针系统，3 '，6'-Bis（烯丙氧基）-芴，对于细胞的共焦成像结果显示，Hepa 1 -6癌细胞的绿色荧光信号显著高于HL-6癌细胞。为了研究DPM-HD 3-CO对HL-7702和Hepa 1 -6细胞的PTT效应，我们采用钙黄绿素-AM双染法，观察了DPM-HD 3-CO对HL-7702和Hepa 1 -6细胞的PTT效应（染色活细胞，绿色荧光）和碘化丙啶（PI染色死细胞，红色荧光）以评价DPM-HD 3-CO的光毒性。如预期的，在用PBS或PBS +激光处理的细胞中观察到显著的绿色荧光，表明所用激光的光毒性低。用DPM-HD 3-CO +激光处理细胞后，Hepa 1 -6细胞发出明显的红色荧光，而HL-7702细胞发出绿色荧光，说明该探针可以选择性杀伤癌细胞，通过MTT法进一步评估细胞的存活率，经PBS +激光或探针处理后，HL-7702和Hepa 1 -6细胞的存活率仍为82%，表明只有激光照射或探针处理对正常细胞或癌细胞的毒性较小。探针+激光处理的结果表明，HL-7702细胞的存活率仍高于80%，而Hepa 1 -6细胞的存活率约为10%，这些结果表明，DPM-HD 3-CO可作为一种CO激活的治疗诊断剂，用于癌细胞的原位光热治疗，且副作用小。
使用活化的治疗诊断剂的体内多模态成像
为了评估体内NIR-II FL成像性能，将DPM-HD 3 CO分别注射到小鼠大腿的正常肌肉组织和肿瘤中，然后记录并分析它们的NIR-II FL 950信号。在小鼠大腿的正常肌肉组织和肿瘤中没有观察到显著的FL 950信号注射DPM-HD 3-CO 0.5小时后，肿瘤部位的FL 950强度显著高于是正常肌肉组织的4.2倍这表明肿瘤中的CO水平高于正常肌肉组织中的CO水平，并且肿瘤微环境中丰富的CO可以激活DPMHD 3-CO的荧光信号。随着时间的推移，肿瘤处的NIR-II FL信号逐渐降低，这可能是由于小鼠体内活化探针的代谢所致。值得注意的是，即使在48小时后，在肿瘤部位继续观察到显著的NIR-II FL信号，这表明DPM-HD 3-CO在长时间监测和跟踪肿瘤发展方面具有巨大的潜力。此外，我们进行了肿瘤的3D比率PA成像。在注射探针后0 h，肿瘤部位观察到强的PA 690信号和弱的PA 900信号，PA 900/PA 690比值为0.34。随着时间的推移，PA 690信号逐渐减弱，而PA 900信号逐渐增强，随着时间的推移，PA 900/PA 690的信号强度下降至约0.89，这可能是由于在异质组织中细胞摄取探针时的代谢、清除或不同性质所致。值得注意的是，由于其在肿瘤组织中良好的保留能力，此外，3D PA成像深度分析显示DPM-HD 3-CO的成像深度约为10 mm，结果表明，该探头具有良好的组织穿透深度，能够反映深部肿瘤的空间轮廓DPM-HD 3-CO通过3D PA成像对组织进行三维成像，为癌症的检测提供深层无创解剖信息。充分利用FL技术的高灵敏度，以及PA成像良好的穿透能力和空间分辨率，DPM-HD 3-CO可以为癌症提供全面的诊断信息，有利于指导医生定制个性化治疗方案。我们研究了探针DPM-HD 3-CO在荷瘤小鼠中的光热成像性能，探针+激光组的光热信号随着照射时间的增加而逐渐增加，在5分钟内达到55.9 °C。PBS +激光组照射6 min后，肿瘤部位温度仅略有升高，说明肿瘤内CO水平的升高可激活DPM-HD 3-CO的光热特性，从而减轻光热对正常组织的损伤，实现原位激活光热治疗的效果，体内代谢和主要器官的荧光成像显示，探针可以在肿瘤部位响应，并且可以通过体内肝脏代谢清除。这些结果表明，激活的探针DPM-HD 3-CO可以执行NIR-II FL，PA，以及肿瘤内内源性CO水平增加的光热三模式成像，具有体内长期伴随诊断的潜力。
用于分步成像引导个性化光热治疗的可激活多模式治疗诊断剂
我们提出了一种分步成像引导治疗方法，可以通过检测特定的生物标志物来监测患者在不同阶段的治疗反应，从而为不同患者制定个性化治疗方案。基于其独特的双属性多模式特性，试剂DPM-HD 3-CO能克服非均相聚集的影响，我们研究了治疗诊断剂DPM-HD 3-CO用于癌症分步成像引导治疗的光疗效果，将荷Hepa 1 -6肿瘤的裸鼠随机分成四组：PBS、PBS +激光、DPM-HD 3-CO和DPM-HD 3-CO +激光组。治疗组小鼠在不同治疗阶段的多模式成像是必要的，以指导精确的光热治疗。在临床实践中，肿瘤治疗过程中最具挑战性的问题是判断大肿瘤治疗后是否有微小肿瘤残留，并准确破译微小肿瘤的空间分布。而PA成像具有灵敏度高、空间分辨率高、成像深度深等综合优势，是肿瘤治疗中理想的诊断方法。（20 μM，100 μL）瘤内注射到肿瘤中，随后注射NIR-II FL，PA，实验结果表明，增强的近红外-Ⅱ荧光成像（5.89倍），PA 900/PA 690（5.31倍），与正常小鼠大腿肌肉组织相比，Hepa 1 -6荷瘤小鼠肿瘤部位的PT信号（对照组）。可以基于激活的3D PA信号获得诊断信息，例如治疗前阶段的肿瘤位置、深度和空间分布。同时，通过热成像评价肿瘤小鼠对光热治疗的反应，在第一步治疗中，小鼠瘤内注射100 μL DPM-HD 3-CO（20 μM），然后在肿瘤部位进行分段照射（808 nm，1 W/cm 2）照射6 min，重复4次，每次间隔20 min，第一步照射结束后第9天，分别用NIR-II FL，PA 900/PA 690，并进行PT显像评价疗效及预后。
第一步治疗后，如果肿瘤已经完全根除，治疗部位的FL和PA 900/PA 690信号应无明显增强，但小鼠体内仍观察到NIR-II FL、PA 900/PA 690和PT信号，表明其体内残留微小肿瘤，此时，三维PA成像可在微观空间尺度上观察残留肿瘤的空间位置和深度，指导进一步治疗。此外，我们对预处理组和第一步处理组的肿瘤进行了离体和苏木精-伊红（H&E）分析。实验结果表明，第一步治疗组与治疗前相比仍有肿瘤残留在确认残留肿瘤的存在后，进行第二步PTT治疗以根除残留肿瘤。（20 μM，100 μL，包括10 μM PdCl 2）直接瘤内注射到残留肿瘤区域，然后用808 nm激光分次照射肿瘤部位，每次三次，在完成第二步PTT治疗后，NIR-II FL，PA 900/PA 690，Hepa 1 -6荷瘤小鼠的PT信号强度与正常对照组几乎相同，表明肿瘤基本上完全根除。这些结果表明，DPM-HD 3-CO可以克服癌症异质环境的干扰，为癌症治疗的不同阶段提供高保真的多模式诊断信息，从而提高癌症治疗的准确性，实现个性化治疗。在治疗36天后，PBS、DPM-HD 3-CO和PBS +激光治疗组中的小鼠的存活率均降低至0%。DPM-HD 3CO+激光组在治疗25天后表现出87.5%的高存活率。此外，在整个50天的研究期间，小鼠的存活率始终保持在87.5%，没有观察到复发。DPM-HD 3-CO +激光治疗组生存率的显著改善反映了分步成像引导治疗策略的实质性优势。为了进一步评估分步成像引导治疗策略的疗效，结果表明，PBS组和DPM-HD_3CO组对肿瘤无明显治疗作用相反，DPM-HD 3-CO +激光组显示出显著的肿瘤生长抑制作用，证明该探针的光热性质可在肿瘤部位特异性激活，并具有良好的抗肿瘤活性。在治疗期间每2天测量小鼠的肿瘤大小和重量以评估治疗效果和副作用。在没有激光照射的情况下，肿瘤生长保持稳定。但是，当肿瘤内注射探针并进行光治疗时，肿瘤生长得到有效抑制，并呈现完全消除的趋势。此外，探针+激光组小鼠的体重在治疗开始时略有下降，但随着治疗时间的延长而逐渐增加，表明探针DPM-HD 3-CO具有良好的抗肿瘤活性。
总结
我们提出了ACQ/AIE双性能多峰发光材料DPMgens的概念，DPMgens能够同时平衡溶液和固体中的辐射和非辐射跃迁，表现出稳定的ACQ/AIE双性能多峰发光。DPM-HDs通过在分子和形态水平上操纵平面骨架和扭曲基团，实现了对平面骨架和扭曲基团的多峰发光，克服了异质累积效应的影响，从而实现了复杂环境下的高保真多峰发光，利用DPM-HDs独特的ACQ/AIE双属性多峰发光特性，我们成功定制了一种可激活的双属性多模式治疗剂DPM-HD 3-CO，用于分步成像引导的癌症异质性治疗，该治疗剂DPM-HD 3-CO可以克服肿瘤异质性引起的干扰，并用于揭示治疗不同阶段中CO水平与治疗反应的关系，实现肿瘤的精确检测和个性化治疗。固-液多模态探针的发展不仅为异质性肿瘤的高保真检测和精确治疗提供了途径，而且可能为其他异质性疾病和复杂环境的监测开辟机会。更重要的是，DPMgens的发展已经解决了聚集和分散对传统单态染料的光学性能的影响，因此预示着双态多峰化学染料的时代的到来。这一突破为生物医学成像、环境监测、化学传感器、光电器件等领域的研究和应用提供了有希望的可能性和前瞻性方向。
参考文献
Activatable second-near-infrared-window multimodal luminogens with aggregationinduced-emission and aggregation-causedquenching properties for step-imaging guided tumor therapy,Wenxiu Li , Sixin Ai , Huayong Zhu & Weiying Lin,Nat. Commun.| (2025) 16:2471,https://doi.org/10.1038/s41467-025-57673-1
