内容提要
本文开发了一种新的荧光和显色探针罗丹明B螺内酰胺（1），它在水溶液中NO诱导的螺环打开反应后。表现出对 NO 检测的高选择性和灵敏度“开启”型光谱响应。
一氧化氮（NO）近来越来越被视为在许多生理和生物学重要过程中的关键生物分子。它不仅在心血管系统中发挥着重要作用，在中枢和外周神经系统以及免疫系统中也至关重要。本文报道了一种通过新的分子内途径检测一氧化氮（NO）的新型发光探针（化合物 1）。该探针在水溶液中对 NO 表现出灵敏且选择性高的 “开启” 型荧光和显色行为，可用于在正常生理条件下检测 NO。新探针 1 以罗丹明 B 为原料，通过 “一锅法” 合成，产率较高。从CH2Cl2/CH3CN中结晶后得到无色且无荧光的产物。在 pH 7.4 的水溶液中，该化合物同样呈无色，这表明其主要以螺环形式存在。NO 的传感过程如方案 1 所示，化合物 1 的氨基受到 NO 的攻击发生重氮化反应，进而诱导螺环打开，生成罗丹明 B 酰基苯并三唑（化合物 2），它属于罗丹明 B 叔酰胺类物质，展现出与罗丹明 B 相似的强吸收和荧光特性 。化合物 2 在水溶液中不稳定，会进一步水解生成罗丹明 B 和苯并三唑。
在 0.10M、pH 7.40 的磷酸钠缓冲溶液（H2O - CH3CN = 80/20)，体积比）中，单独的化合物 1 在较长波长范围（(λ >400nm)）内既没有吸收峰也没有荧光峰，并且由于其螺环结构，溶液呈无色。加入 NOC13 后，一种 NO 供体 ，在 37°C 下将其加入到化合物 1 中，会在约 554nm 处产生一个强吸收峰，在发射波长(λem)约 574nm 处产生一个强荧光峰，这与罗丹明 B 发色团的吸收峰和发射峰相似。化合物 1 与 NO 反应导致的这种显著的荧光增强和强烈的颜色变化（从无色变为品红色）可以很容易地用肉眼观察到。
我们检测了化合物 1 溶液对 NO 的动态吸收光谱和荧光光谱。将 NO 通入无色的化合物 1 溶液中，溶液立即变为强烈的品红色，在首次检测（30 秒）时，溶液在约 569nm 处的吸光度达到最大值，之后溶液的吸收光谱逐渐发生蓝移，直至达到平衡，吸收峰位于 554nm 处（约 30 分钟）。此时总的蓝移量为 15nm，这与罗丹明 B 叔酰胺和罗丹明 B 之间的吸收波长变化相符 。相应地，荧光发射光谱也呈现出类似的蓝移效应（约 19nm），从约 592nm（最大激发波长λex≈570nm）蓝移至 574nm（λex=554nm）。该实验结果表明，NO 使化合物 1 的螺环打开的反应在最初 30 秒内就能完全发生。基于 NO 诱导化合物 1 开环的机制，反应最初 0.5 分钟内化合物 1 溶液的荧光光谱主要归因于罗丹明 B 叔酰胺 2 的生成（激发波长λex/ 发射波长λem：570/592nm），而 30 分钟后测量的荧光光谱则主要归因于产物中的主要成分罗丹明 B（激发波长λex/ 发射波长λem：554/574nm），这是由于化合物 2 逐渐水解，释放出游离的罗丹明 B。因此，反应 30 分钟内的总荧光强度主要来自罗丹明 B 叔酰胺 2 和罗丹明 B，而 30 分钟后测量的荧光则主要来自罗丹明 B。
我们也研究了 pH 对荧光的影响。我们的探针 1 在 pH > 3 时不发荧光，这意味着化合物 1 在较宽的 pH 范围内都能保持螺环形式。重要的是，我们发现 NO 与 1 的反应产物的荧光在 pH 大于 5 时也不依赖于 pH。这些事实表明，探针 1 在较宽的 pH 范围（pH > 5）内都能很好地作为检测 NO 的荧光化学传感器，因为它避免了荧光强度对 pH 的依赖性。
为了评估探针 1 检测 NO 的性能，使用NOC13（释放 NO 的半衰期为 13.7 分钟 ）对 NO 进行荧光滴定实验。在 37°C 下，向 0.10M 磷酸钠缓冲溶液（pH 7.40）中的 10µM 探针 1 溶液中滴加 NOC13，并在反应 30 分钟后测量荧光强度。加入 1.0 当量的 NOC13 后，探针 1 溶液的荧光强度增加了约 2400 倍，最大发射波长为 574nm，计算得出 NOC13 的检测限为 3.0nM。尽管探针 1 反应活性较高，但它对 NO 的选择性相较于其他含氧物种如(H2O2、NO2-)、NO3-)、O2-)和・OH仍然很高。除了 NO 之外，这些含氧物质与化合物 1 反应不会产生可检测到的荧光。在分光光度行为方面，探针 1 也表现出同样的选择性。我们还注意到，在 pH 7.4 的溶液中，ONOO⁻溶液与探针 1 的反应同样强烈。ONOO⁻是一氧化氮（NO）和O2-在生理环境中自发反应生成的，半衰期极短（<20ms），它可能会可逆地分解为 NO 和O2-) 。由于探针 1 不与O2反应，为了验证与探针 1 反应的是 ONOO⁻本身还是溶液中分解产生的 NO，我们进行了对照实验。因为 ONOO⁻在碱性溶液（pH>10）中相当稳定 ，所以分别在 pH 12.4（0.10M KCl - NaOH 缓冲溶液）的条件下，用 NO 和 ONOO⁻溶液处理探针 1。结果显示，探针 1 对 NO 溶液产生强烈的吸光度和荧光响应，而对稳定的 ONOO⁻溶液则几乎没有吸光度和荧光响应，这表明探针 1 不与 ONOO⁻离子反应。因此，我们可以得出结论，在生理环境（pH 7.4）中，探针 1 实际上并不是与 ONOO⁻本身反应，而是与溶液中分解产生的 NO 反应，这进一步证实了探针 1 对 NO 的选择性。
总结
我们开发了一种基于罗丹明螺内酰胺骨架的 NO 诱导开环反应这一新型发光机制的 “开启” 型显色和荧光 NO 探针。与已报道的 NO 荧光探针相比，该探针具有以下优势：合成快速、简单且便捷。此外，探针本身的溶液无荧光且无色（“纯净空白”）；因此，对 NO 可实现更显著的荧光增强和明显的颜色变化，这极大地有利于提高 NO 检测的灵敏度以及生物成像研究的效果。
参考文献
Fluorogenic and Chromogenic Rhodamine Spirolactam Based Probe for Nitric Oxide by Spiro Ring Opening Reaction,Hong Zheng,* Gui-Qin Shang, Shi-Yao Yang, Xia Gao, and Jin-Gou Xu,Org. Lett., Vol. 10, No. 12, 2008,DOI:10.1021/ol800206x
