内容提要
本工作以半菁类近红外探针CyOH为基础，通过连接一个2-羟基-N-甲基，（甲氨基）苯甲酸酯。Cy-MB中的（甲基氨基）苯甲酸酯不仅作为荧光猝灭基团，而且是FA再生底物。这种分析物再生NIR探针可以被内源性FA特异性激活，导致显著的荧光信号开启并伴随着FA再生。因此，与一些报道的FA荧光探针相比，探针Cy-MB表现出用于FA的NIR成像检测而不干扰内源性FA的体内平衡的优势。该探针具有良好的分析性能，对FA具有较高的选择性和灵敏度，检测限为0.67 μM最终，Cy-MB成功应用于癌细胞和荷瘤小鼠中内源性FA的检测。
Cy-MB探针的设计
我们筛选了半菁基近红外探针CyOH，因为其具有良好的可调谐性和高的荧光量子产率。将2-（甲氨基）苯甲酸酯引入到CyOH中，形成新型近红外探针Cy-MB，而2-（甲氨基）苯甲酸酯引入到CyOH中，（甲氨基）苯甲酸酯中的亚氨基不仅作为荧光猝灭基团，而且作为FA再生底物。（甲氨基）苯甲酸酯可以特异性地与FA反应，然后通过简单的级联反应再生FA并“打开”近红外荧光信号所示合成Cy-MB通常，根据先前报道的方法合成CyOH。将CyOH与2-在二环己基碳二亚胺（DCC）和4-二甲基氨基吡啶（DMAP）的存在下，用（甲基氨基）苯甲酸处理样品以产生NIR探针Cy-MB。
Cy-MB对甲醛的响应
用Cy-MB研究了Cy-MB对FA的紫外-可见吸收光谱和荧光光谱，，游离Cy-MB最初显示蓝色，在584 nm处有强吸收峰，在710 nm处有极弱的荧光发射（1b，黑线）.与FA孵育后，Cy-MB的吸收光谱和荧光光谱发生显著变化，在λab = 679 nm处出现新的红移吸收峰，此外，Cy-MB与FA的反应引发了显著的荧光信号增强，这使得通过荧光检测内源性FA成为可能。为了进一步评价Cy-MB对FA的检测能力，进行了Cy-MB与FA的滴定实验，随着FA浓度的增加，Cy-MB的荧光强度在一定时间内逐渐增强，在λex/em = 679/710 nm处绘制荧光强度与FA的对数响应曲线，以及良好的线性方程在2.5 ~ 250 μM范围内，相关系数R2 = 0.995，检出限（3 σ/k）为0.67 μM，这使得生物系统中FA浓度的定量分析成为可能[2]。此外，研究了Cy-MB的光稳定性。在连续照射3600 s后，荧光强度变化不大，表明Cy-MB具有足够的光稳定性用于生物成像。同时，通过测量710 nm处的荧光强度变化，研究了Cy-MB对FA的响应时间。加入FA后，荧光信号逐渐增强，并在100 min时达到平台。这些结果表明，Cy-MB可实现内源性甲醛的荧光检测，检测限低，稳定性好。（甲氨基）苯甲酸酯可以与甲醛发生亲核反应，形成氨基缩酮中间体1 。之后，氨基缩酮中间体中的羟基与酯基通过分子内亲核反应生成CyOH和2-对Cy-MB、CyOH和2-（甲氨基）苯甲酸酯的FA活化产物进行了分析。如图2所示，Cy-MB显示保留时间为7.39分钟的HPLC峰。然而，Cy-MB与FA反应产生对应于CyOH的新峰（保留时间，R = 5.04分钟）出现，而对应于Cy-MB的HPLC峰降低。m/z 384.1949处的新峰（对应于CyOH）和m/z 152.0708在与FA孵育的Cy-MB的HRMS光谱中观察到2-（甲氨基）苯甲酸这些结果一致地证明Cy-MB可以与FA反应以形成CyOH并再生FA。考虑到复杂的细胞内环境，研究了Cy-MB对相关分析物（例如氨基酸、醛化合物和其他生物分子）的选择性。甲醛和其他相关分析物之间荧光强度的这种显著差异表明，Cy-MB对甲醛具有高选择性。
细胞毒性和细胞成像
受到Cy-MB良好生物相容性的鼓舞，通过共聚焦显微镜荧光图像，研究了Cy-MB在人乳腺癌细胞系MCF-7中FA成像中的潜在应用MCF-7细胞用（i）PBS、（ii）Cy-MB、（iii）Cy-MB和FA以及（iv）CyMB和NaHSO 3处理（FA清除剂）用PBS处理的细胞显示出可忽略不计的荧光信号，这表明自发荧光较低。然而，用Cy-MB处理的细胞观察到显著的胞内荧光信号。这可能是由于MCF-7细胞中的内源性FA可以有效地与Cy-MB反应并打开其NIR荧光。此外，当将外源性FA加入MCF-7细胞中时，细胞显示出更高的荧光信号，表明细胞内荧光信号的强度与FA的浓度有关。当MCF-7细胞的内源性FA被NaHSO 3预处理消耗时，几乎没有观察到荧光信号，再次证明荧光增强与内源性FA的浓度相关。此外，细胞定位结果表明，CyOH定位于活化后的MCF-7细胞线粒体，Pearson相关系数为0.85，这与其他报道的工作一致[39-41]。总体而言，这些结果表明，所提出的分析物再生近红外荧光探针Cy-MB可以被细胞中的FA有效激活，并打开其荧光信号用于成像。
Cy-MB肿瘤成像
进一步研究了Cy-MB在4 T1荷瘤小鼠中的肿瘤荧光成像能力。在用Cy-MB处理后的给定时间点，通过体内成像系统获得荷瘤小鼠的荧光图像。用盐水处理的小鼠用作对照。用游离盐水处理的小鼠在肿瘤部位显示出可忽略的荧光信号，并且随时间变化很小。然而，Cy-MB处理组小鼠肿瘤部位可见明显的近红外荧光信号，且荧光信号随时间逐渐增强，在注射后3 h达到最大值。肿瘤部位的这种荧光信号增强可归因于肿瘤细胞中高水平的内源性FA。小鼠体内的荧光强度逐渐减弱，表明Cy-MB的活化产物CyOH可以随着时间的推移被代谢和排泄。此外，通过离体荧光成像研究了NIR荧光信号在小鼠主要器官中的分布。注射Cy-MB和盐水的小鼠在3小时后被处死，如图5c-d所示，对于用Cy-MB处理的小鼠，仅在肿瘤组织中观察到显著的荧光信号。相反，生理盐水处理的肿瘤和其他器官观察到可忽略的荧光信号。这可能归因于探针Cy-MB可被肿瘤细胞中高水平的内源性FA激活，并且肿瘤内注射后荧光信号增强。同时，正常器官中低浓度的内源性FA不能有效地激活Cy-MB，因此在正常器官中没有观察到显著的荧光信号。总之，所有上述结果都很好地证明了Cy-MB可以被肿瘤中的内源性FA有效地激活用于癌症诊断。
总结
我们成功地开发了一种新的分析物再生近红外探针Cy-MB内源性FA检测。Cy-MB可被FA特异性激活，产生荧光信号，并伴有FA的再生。实验结果表明，Cy-MB对FA具有良好的分析性能，具有较高的选择性和灵敏度。此外，正如预期的那样，Cy-MB可用于检测活细胞和荷瘤小鼠的内源性FA。因此，我们设想Cy-MB将在生物系统中内源性FA的精确成像中提供广泛的应用。
参考文献
Analyte regeneration near-infrared fluorescent probe for endogenous formaldehyde detection in living cells and in vivo,Jin-Yan Li , Jing-Yan Kang , Xiao-Bo Zhao **, Yan-Ping Shi *,Dyes and Pigments 232 (2025) 112457,https://doi.org/10.1016/j.dyepig.2024.112457
