内容提要
我们在此报告一种近红外二区（NIR - II，1.0 - 1.7μm）光激发的 “关 - 开 - 关” NIR - II 荧光探针（NDP）。该探针初始荧光近乎理想的零值，但在肝癌组织中能够开启其 NIR - II 荧光，当从癌组织迁移到正常组织时又能再次关闭荧光，从而最大限度地减少背景干扰 。由于其背景信号低，使用我们的探针进行的盲法研究能够从健康小鼠和患瘤小鼠的混合样本中以 100% 的准确率识别出患有原位肝肿瘤的雌性小鼠，并能够对小至 4mm 的早期原位肝肿瘤进行灵敏定位。
NDPs 的设计与制备
基于萘二酰亚胺染料，设计并合成了一种响应型近红外二区荧光小分子（ND）。通过拓宽萘二酰亚胺染料的共轭骨架，将其吸收和发射峰转移至近红外二区窗口，从而得到 ND。在 ND 中，2,6 - 二异丙基苯胺基团对于增加其在水中的分子间间距至关重要。测试了 ND 在有机溶剂中的光学性质。如图所示，在四氢呋喃（THF）中，ND 在约 585nm 处有一个主要吸收峰，1000nm 以上无吸收。然而，ND 的还原产物 2H - ND 在 1066nm 处有最大吸收。在 1064nm 激发下，ND 无近红外二区发射。而 2H - ND 在 1138nm 处有一个主要发射峰，在 1316nm 处有一个肩峰。高效探针的一般要求包括良好的生物相容性、优异的水分散性和强大的肿瘤靶向能力。合成了一种 D - 半乳糖（D - Gal）共轭的两亲性 F - 127 聚合物（F - 127 - D - Gal），并通过使用同轴微流控玻璃毛细管混合器的改进纳米沉淀法，将其用于包裹 ND 分子以形成纳米探针（NDPs。由于 D - Gal 基团与肝癌 HepG2 细胞中过表达的半乳糖受体（去唾液酸糖蛋白）存在特异性相互作用，因此被用于增强内吞作用，进而提高探针针对肝肿瘤的靶向活性。透射电镜（TEM）图像显示 NDPs 呈球形，尺寸为 40nm，这与动态光散射（DLS）测量结果相近。同时，NDPs 在 37°C 的磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）和 10% 胎牛血清（FBS）中储存 48 小时仍保持稳定。当 NDPs 在 2W/cm² 的高功率密度下，用 1064nm 激光照射 5 分钟时，几乎未观察到光漂白现象。这些结果表明，NDPs 适用于体内成像。
探针在体外对 H2S 和 ROS 的 “关 - 开 - 关” 响应
首先在体外评估了 NDPs 对 H2S 的光学传感性能。NDPs 在约 596nm 处有一个主要吸收峰，800nm 以上无吸收。为模拟生物体系中的 H2S 环境，采用硫氢化钠（NaHS）作为 H2S 供体，它能在水中快速释放 H2S 气体 。加入 NaHS 后，NDPs 在约 596nm 处的吸收峰显著降低，同时在 1112nm 处出现一个吸收峰，等吸收点为 700nm，其摩尔吸光系数 ε 为 5.0×10⁵ M-1cm-1。吸收峰如此大的红移（516nm）归因于 H2S 诱导 NDPs 中荧光团结构从 ND 转变为 2H - ND。随着吸收变化，悬浮液颜色从蓝色变为棕黑色。在 37°C 的磷酸盐缓冲液（PBS，pH = 7.4）中记录了 NDPs 随 NaHS 浓度变化的近红外二区（NIR - II）发射光谱。由于 NDPs 在 800nm 以上无吸收，在 1064nm 激光激发下，未添加 NaHS 时的初始探针荧光强度近乎理想的零值。加入浓度从 0 - 32μM 的 NaHS 后，在 1064nm 激发下，NDPs 的近红外二区发射逐渐增强，最大发射波长为 1216nm，在水中的近红外二区荧光量子产率为 0.03%（以 IR - 26 为参考，其量子产率为 0.05% ）。得益于近乎理想的零初始探针荧光强度，NDPs 对 NaHS 的荧光开启比率约为 12000 倍。通过小型活体动物近红外二区（NIR-II）荧光成像系统，以伪红热图的形式进一步记录不同 NaHS 浓度的 PBS 溶液中 NDPs 的近红外二区荧光图像（1100–1700nm）。如图所示，纯 PBS 溶液的空白荧光强度与初始探针荧光强度（0μM NaHS）相近，这表明 NDPs 的初始探针荧光强度近乎理想的零值。NDPs 的近红外二区荧光图像显示，随着 NaHS 浓度的增加，近红外二区荧光（伪红热图）逐渐增强。当 NaHS 浓度从 0 增加到 32μM 时，呈现出线性趋势。NDPs 对 NaHS 的检测限（3σ/k）约为 5nM，这足以满足肿瘤中的体内成像需求 。此外，NDPs 对 NaHS 的反应动力学表明其响应迅速，反应在 90 秒内即可完成，为体内实时成像提供了可能。通过监测 NDPs 在与各种疑似分析物（1mM）处理后在 1216nm 处的近红外二区荧光变化，研究了 NDPs 对 NaHS 的选择性，这些分析物包括 β- 巯基乙醇（BME）、二硫苏糖醇（DTT）、谷胱甘肽（GSH）、L - 半胱氨酸（L-Cys）、同型半胱氨酸（Hcy）、维生素 C（VC）、维生素 E、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）、硫氧还蛋白和血红素。经处理后，NDPs 的近红外二区荧光明显增强，而在其他生物相关分析物存在时则无此现象，这表明 NDPs 对具有高选择性。同时，NDPs 对的荧光开启比率不受生理 pH 值（4.0–9.0）和温度（29–45°C）变化的影响。因此，NDPs 有望为体内肿瘤成像提供低背景、高特异性和高灵敏度的检测。随后，我们在体外研究了 2H - NDPs 对活性氧（ROS）的近红外二区（NIR - II）荧光传感能力。2H - NDPs 是通过向 NDPs 中加入得到的 。我们首先选择次氯酸钠（NaClO）作为代表性的活性氧物种，研究其如何改变探针的光学性质。加入 NaClO 后，2H - NDPs 在 1112nm 处的吸收峰显著降低，直至接近零，同时 596nm 处的吸收峰增强，这与对 NaHS 响应的过程相反。与此同时，加入 NaClO 后，2H - NDPs 的棕黑色溶液又变回蓝色。正如预期的那样，用 NaClO 滴定后，1216nm 处的近红外二区发射逐渐减弱至近乎理想的零值。相应地，随着 NaClO 浓度的增加，PBS 溶液中 2H - NDPs 的近红外二区荧光强度（伪红热图）逐渐降低，直至与纯 PBS 溶液的荧光强度相同。2H - NDPs 对 NaClO 的检测限（3σ/k）为 8nM。NaClO 诱导的近红外二区荧光衰减动力学在 80 秒内完成。除了 NaClO，其他氧化性物质，如、过氧亚硝酸根（ONOO⁻）和羟基自由基（・OH），也能在一定程度上降低 2H - NDPs 的荧光。
2H - NDP 信号在正常组织中关闭的体内研究
静脉注射的 “关 - 开” 或 “关 - 开 - 关” 型探针在体内的过程分为两步：首先，探针持续在肿瘤中积累，随后被激活；其次，这些被激活的探针从肿瘤迁移至正常组织，这一动态过程在整个成像期间持续发生。虽然 “关 - 开” 和 “关 - 开 - 关” 型探针的第一步相同，但在第二步中，传统 “关 - 开” 型探针的激活产物，即 “常开” 型探针，即使迁移到正常组织中也会持续发出信号。相比之下，“关 - 开 - 关” 型探针的激活产物在迁移到正常组织时能够关闭信号，从而比 “关 - 开” 型探针产生更低的背景信号。对于我们的 “关 - 开 - 关” 型探针（NDPs），其激活产物（2H-NDPs）在正常组织中能够变回 NDPs，从而关闭信号。细胞实验也表明，激活后的探针（2H-NDPs）确实能够从肿瘤细胞中迁移出来。为进一步证明我们的假设，即 “关 - 开 - 关” 型探针的第二步能比 “关 - 开” 型探针产生更低的背景信号，也就是正常组织能够关闭 2H-NDPs 的信号，我们合成了 Me-H-ND，它有一个甲基阻断了 2H-ND 两个氢反应位点中的一个，然后将其封装到 F127-D-Gal 中，得到 “常开” 型探针（Me-H-NDPs）作为对照。此外，2H-NDPs 和 Me-H-NDPs 具有相似的表面、形状，平均流体动力学尺寸均为 40±1nm。Me-H-NDPs 在添加活性氧（ROS）前后的荧光几乎没有变化。在 1064nm 激发下，注射后 0 到 24 小时内，对照的 Me-H-NDPs 在全身的信号强度高于 2H-NDPs 组。此外，对注射后 24 小时离体主要器官的近红外二区（NIR-II）成像显示，Me - H - NDPs 在肝脏中的荧光强度是 2H - NDPs 的 3.2 倍。这些结果表明，正常组织能够关闭 2H - NDPs 激活后的近红外二区荧光。为进一步探究正常组织将 2H - ND 转化为 ND 的潜力，将 2H - NDPs 和对照 PBS 溶液分别皮下注射到健康小鼠的背部。12 小时后，基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI - TOF）检测显示，在接受 2H - NDPs 处理的小鼠肝脏组织中，检测到主要的 ND 分子量（计算质荷比 m/z = 1674.28；实测 1674.806）。这一发现表明，2H - NDPs 中的 2H - ND 在体内正常组织中确实能够转化为 ND。为研究 2H - NDPs 从肿瘤迁移到正常组织这一过程的影响，将 2H - NDPs 和对照 Me - H - NDPs（浓度 0.8 mg/mL，体积 25 μL）注射到皮下接种 HepG2 肿瘤的小鼠肿瘤部位。从注射后 0 到 24 小时，2H - NDPs 和对照 Me - H - NDPs 在小鼠全身的荧光逐渐增强，这可归因于探针从肿瘤部位迁移到全身。正如预期的那样，在同一时间点，Me - H - NDPs 在正常组织中的荧光信号，尤其是肝脏明显强于 2H - NDPs 组。即使在注射探针 24 小时后，Me - H - NDPs 组正常组织（NT4 和 NT6）的荧光强度仍约为 2H - NDPs 组（NT1 和 NT3）的 2 倍。
H2S与皮下肝肿瘤的近红外二区（NIR - II）荧光成像
首先，研究了 NDPs 表面的 D - 半乳糖（D - Gal）对 HepG2 细胞的靶向能力。含有 D - Gal 基团的 NDPs 在 HepG2 细胞中的近红外二区（NIR - II）荧光强度强于不含 D - Gal 基团的 NDPs。此外，HepG2 细胞对 NDPs 的摄取量高于正常细胞，如 3T3 细胞和 HEK 293 T 细胞。再者，在荷瘤小鼠的 HepG2 肿瘤中，含有 D - Gal 基团的 2H - NDPs 的近红外二区荧光强度也强于不含 D - Gal 基团的 F127 - NDPs。这些数据表明 D - Gal 具有较高的靶向能力。我们首先检测了 NDPs 在肿瘤 HepG2 细胞中的成像能力和特异性响应效果。与仅用 NDPs 处理的 HepG2 细胞相比，经外源 NaHS 预处理后的 HepG2 细胞，其近红外二区荧光显著增强。相反，用能够清除的进行预处理，则会显著降低近红外二区荧光。用生物合成的前体 L - Cys 刺激 HepG2 细胞，会使近红外二区荧光增强，而加入 NaClO 抑制该荧光后，其强度明显减弱。这些发现表明 NDPs 对具有特异性响应。1064 nm 激发的近红外二区荧光成像呈现出显著高的肿瘤与正常组织（T/NT）信号比。注射后 12 小时，NDPs 的平均 T/NT 为 31.22，远高于罗斯准则（T/NT 比达到 5 才能 100% 确定地区分图像特征）。更重要的是，注射 NDPs 后，T/NT 比从 1 小时起就超过了罗斯准则，并持续了 12 小时。在临床实践中，T/NT 比长时间高于罗斯准则应有助于更好地精确识别肿瘤和进行手术切除。
总结
本研究我们开发了近红外二区（NIR-II）激发的 “关 - 开 - 关” 型近红外二区荧光探针（NDPs），该探针具有近乎理想的初始零荧光特性。与传统的 “关 - 开” 型探针相比，NDPs 具有多种独特性质，这些性质使其在体内高灵敏度分子成像方面具有显著优势：（1）传统的 “关 - 开” 型探针设计基于光物理过程来猝灭和恢复荧光，例如聚集诱导发光、光致电子转移和荧光共振能量转移等，而我们的探针设计策略基于激活前后探针吸光度的大幅红移，这使得探针在正常组织中呈现近乎理想的初始零荧光；（2）该探针具有良好的 1064 nm 激发和近红外二区发射特性，能够在肝脏组织自发荧光可忽略不计的情况下，增加组织穿透深度 ；（3）具有 “关 - 开 - 关” 的近红外二区荧光特性，在从肿瘤组织迁移到正常组织时能够失去荧光信号；（4）对硫化氢响应时具有高达约 12000 倍的超高荧光开启比率，从而增强肿瘤信号。这些优势赋予了 NDPs 高的分子成像灵敏度，使我们能够在健康小鼠和肿瘤小鼠的混合样本中以 100% 的准确率无创筛查出患有原位肝肿瘤的小鼠。
参考文献
NIR-II-excited off-on-off fluorescent nanoprobes for sensitive molecular imaging in vivo,Yufu Tang, Yuanyuan Li, Chunxu He, Zhen Wang , Wei Huang, Quli Fan & Bin Liu ,Nat. Commun | (2025) 16:278,https://doi.org/10.1038/s41467-024-55096-y
