内容提要
选择合适的荧光团是设计一种能够在体内识别 HOCl 的理想探针的首要重要步骤。MB是一种近红外（NIR）荧光团，在水溶液中，于 550 - 700nm 波长范围内有强吸收，在664nm 处达到最大吸收。然而，MB 的还原形式（无色亚甲蓝，LMB）不具有荧光性，且仅在紫外区域有吸收。LMB 及其衍生物的氧化会产生强烈的吸收变化，并伴随近红外发射。因此，LMB 及其衍生物是构建可利用荧光和吸收变化来识别特定分析物的探针的理想框架。
探针的设计与次氯酸（HOCl）的反应机理
我们设计并合成了四种不同的 LMB 衍生物。LMB 的甲酰基衍生物 FDOCl - 1在温和条件下可被 HOCl 迅速（<30s）去甲酰化，从而再生 MB，同时颜色和近红外发射发生显著变化。FDOCl - 1 检测 HOCl 的反应机理如图所示。在反应的第一步，FDOCl - 1 的醛基被 HOCl 氧化为羧酸，形成相对不稳定的氨基甲酸衍生物。随后，该衍生物在水溶液中迅速水解，生成不稳定的 LMB，LMB 进而被氧化为 MB。
FDOCl - 1 对次氯酸（HOCl）具有高灵敏度和高选择性
在模拟生理条件（10mM 磷酸钠缓冲液（PBS），pH 7.2，含 0.1% 乙醇）下，通过光谱法评估了 FDOCl - 1 检测 HOCl 的能力。由于 FDOCl - 1 两个苯胺部分之间的电子通信被中断，破坏了化合物的共轭体系，因此在可见光区域既未检测到其荧光，也未检测到吸收。用 HOCl（25mM，2.5 当量）处理后，FDOCl - 1 在 686nm 处的荧光强度增加了 2068 倍，在 664nm 处的吸光度增加了 577 倍。FDOCl - 1 与 HOCl 反应后的荧光量子产率和亮度分别为 2.0% 和 1154 M⁻¹cm⁻¹。由于 FDOCl - 1 的快速去甲酰化反应，其在 HOCl 存在下荧光和吸光度的变化可能是已报道探针中最大的。值得注意的是，即使是低浓度（1mM，0.1 当量）的 HOCl 也能使 FDOCl - 1 的荧光强度增加 78 倍。通过 FDOCl - 1 的吸收和荧光变化评估的 HOCl 检测限分别低至 3.98nM 和 2.62nM（，低于大多数 HOCl 传感器，但略高于报道的最佳传感器（表 S1†中的 HKOCl - 3）。这些数据表明 FDOCl - 1 对 HOCl 具有极高的灵敏度。
为验证 FDOCl - 1 对 HOCl 的选择性，在添加 HOCl 和其他分析物后记录了荧光和吸收变化。在 10mM PBS（pH 7.2，含 0.1% 乙醇）中，10mM HOCl 存在时，FDOCl - 1（10mM）的荧光强度变化比 100mM（10 当量）的类似活性氧 / 氮物种（ROS/RNS），包括、、叔丁基过氧化氢（t - BuOOH）、一氧化氮（NO）、过氧自由基（ROO˙）和过氧亚硝酸根存在时大 631 倍以上。这种选择性高于先前报道的 HOCl 探针（表 S1†）。即使是高活性的氧自由基，如羟基自由基（˙OH）和叔丁基过氧自由基（t - BuOO˙），也不会显著增强 FDOCl - 1 的荧光强度。还测试了 FDOCl - 1 对一些常见阴离子、阳离子和生物物质的反应性。添加 50 当量的常见阴离子和阳离子，如CH3COO⁻, CO₃²⁻, SO₄²⁻, Cl⁻, ClO₄⁻, F⁻, I⁻, NO₂⁻, S2O₃²⁻, Al³⁺, Ca²⁺, Cu²⁺, Fe³⁺, K⁺, Mg²⁺, NH₄⁺ 和Ni⁺，以及 40 当量的氨基酸，如亮氨酸（Leu）、脯氨酸（Pro）、甘氨酸（Gly）、谷氨酰胺（Gln）、谷氨酸（Glu）、甲硫氨酸（Met）、赖氨酸（Lys）、色氨酸（Trp）、丝氨酸（Ser）、苏氨酸（Thr）、天冬氨酸（Asp）、异亮氨酸（Ile）、缬氨酸（Val）、组氨酸（His）和丙氨酸（Ala），均不会使 FDOCl - 1 的荧光强度显著增强。这些测试分析物均未引起吸收光谱的显著变化，进一步证实了 FDOCl - 1 对 HOCl 具有优异的选择性（。值得注意的是，只有 HOCl 能诱导肉眼可清晰观察到的蓝色变化。
FDOCl - 1 用于活细胞中次氯酸（HOCl）检测的评估
由于 FDOCl - 1 对 HOCl 具有高信噪比、出色的选择性和快速响应时间，它应是一种适用于体内检测 HOCl 的探针。为评估 FDOCl - 1 与生物系统的相容性，我们采用甲基噻唑基四唑（MTT）法检测了 FDOCl - 1 在 RAW 264.7 巨噬细胞中的细胞毒性。将 RAW 264.7 巨噬细胞与 40mM 的 FDOCl - 1 孵育 12 小时后，细胞存活率 > 99%，这表明 FDOCl - 1 的细胞毒性极低。为评估 FDOCl - 1 在细胞中检测 HOCl 的能力，我们将负载有 10mM FDOCl - 1 的 RAW 264.7 巨噬细胞分别用不同浓度的外源性和内源性 HOCl 处理，然后使用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）获取细胞图像。如图所示，与 FDOCl - 1 孵育的 RAW 264.7 巨噬细胞未显示荧光。然而，用 HOCl 处理后，细胞胞质中的荧光强度显著增加，且荧光强度与 HOCl 浓度相关。FDOCl - 1 还能够检测由脂多糖（LPS）和佛波醇肉豆蔻酸乙酯（PMA）刺激产生的内源性 HOCl。在实验中，先将 RAW 264.7 巨噬细胞与 FDOCl - 1 孵育，然后用 LPS 和 PMA 处理以诱导内源性 HOCl 的产生。如图所示，随着 PMA 和 LPS 浓度的增加，荧光显著增强，这反映了内源性 HOCl 的生成。此外，实验还加入了髓过氧化物酶（MPO）抑制剂 4 - 氨基苯甲酸酰肼（ABAH）进行对照实验，ABAH 能够降低 HOCl 水平 。如图所示，当细胞与 250mM ABAH 共同孵育时，受刺激细胞的荧光强度受到抑制。
关节炎相关次氯酸（HOCl）生成的体内成像
我们接着在由 λ- 角叉菜胶诱导的小鼠关节炎模型中，运用 FDOCl - 1 进行体内成像研究。选择该模型是因为次氯酸（HOCl）在类风湿性关节炎的关节破坏过程中起着重要作用。实验中，向 8 - 10 周龄小鼠的右胫跗关节（右脚踝）注射不同体积、浓度为 5mg/mL 且溶于 PBS 缓冲液的 λ- 角叉菜胶，以此诱发关节炎；而小鼠的左胫跗关节（左脚踝）不注射 λ- 角叉菜胶，作为对照组。四小时后，向左右脚踝分别注射等量的 FDOCl - 1（100μL，1mM），仅患关节炎的爪部区域在 30 秒内变为蓝色。在对照组的爪部，由于没有 λ- 角叉菜胶诱导的关节炎，即使在注射 FDOCl - 1 120 秒后，也未观察到颜色变化。这些数据表明，FDOCl - 1 能够通过肉眼识别关节炎区域中的 HOCl。 通过荧光成像证实了 FDOCl - 1 在体内对 HOCl 的响应。与对照侧相比，小鼠的关节炎区域在 5 秒内（720 ± 60nm）的近红外范围内迅速显示出强荧光。
总结
我们开发了一种新型基于去甲酰化反应的荧光探针 FDOCl - 1，可在体外通过近红外发射和肉眼快速检测次氯酸（HOCl） 。FDOCl - 1 对超痕量浓度的 HOCl 展现出高灵敏度和选择性（紫外检测限：3.98nM；荧光检测限：2.62nM），这使其能够在多种生物环境中用于检测 HOCl / 次氯酸钠（NaOCl）。该探针可用于对活的 RAW 264.7 巨噬细胞中通过细胞炎症反应产生的内源性 HOCl 水平进行成像。此外，使用 FDOCl - 1 无需任何信号放大器，就能用肉眼轻松识别体内 HOCl 的存在，并且可以通过近红外发射的体内成像来估计体内 HOCl 的水平。
参考文献
Deformylation reaction-based probe for in vivo imaging of HOCl†,Peng Wei,Wei Yuan,Fengfeng Xue,Wei Zhou,Ruohan Li,Datong Zhang and Tao Yi *,Chem. Sci., 2018, 9, 495–501,DOI: 10.1039/c7sc03784h
