内容提要
我们展示了一种很有前途的缓冲策略，通过简单地使用水响应性恶唑烷（Ox）开关来笼住Cy7支架，显著增强了近红外（NIR）发射七甲川花青（Cy7）的光稳定性。这种开关在非荧光闭合形式（CF）和荧光开放形式（OF）之间建立了平衡。有效地补偿了由于光漂白引起的OF损失的异构体。由于在体外和体内环境中都有效，该策略显著地改善了Cy7用于复杂成像技术的耐久性和实用性，包括在活体小鼠中稳定的近红外肿瘤成像和线粒体超分辨率成像。
分子设计策略与化学合成
受分子开关设计的启发，我们设计了一种独特而直接的策略，即利用开关部分来屏蔽和保护荧光团，我们设想的开关部分应满足三个标准：（1）破坏支架的π电子离域并显著改变其吸收和发射光谱，从而屏蔽红光/NIR激光照射;（2）具有最佳pKa，促进其在生物环境中的活化，从而从非活性的预笼化荧光团转化为其活性状态;（3）充当容纳大量预笼化异构体的保护性胶囊，其可以通过热平衡补充光漂白的活性荧光团，从而延长成像持续时间。
基于这些考虑，我们精心设计并合成了Cy 7-Ox，这是一种专门用于评估我们增强Cy 7光稳定性的策略的有效性的化合物。Cy 7-Ox的闭合形式（CF）和开放形式（OF）之间的可逆异构化可以在DMSO中使用交替的酸/碱刺激来调节，伴随着可见的黄色/绿色颜色和NIR荧光关/开切换。CF的最大吸收波长集中在约430 nm处，荧光可忽略不计。三氟乙酸（TFA）的引入引发开环异构化为OF，其特征在于显著的NIR吸收（λabs = 798 nm）和发射（λem = 822 nm和ΦF = 18%）。加入三乙胺（TEA）后，吸收和荧光光谱恢复到其初始状态。
相比之下，当Cy 7-Ox DMSO储备液引入水中时，发生从黄色到绿色的显著颜色变化，表明水引发的从CF到OF的异构化。进一步研究了Cy 7-Ox的pH响应性，当pH从4.17增加到10.23时，CF的最大吸收峰位于λ 415 nm，并逐渐增大，而OF的最大吸收峰位于λ 776 nm，并逐渐减小。同时，（λem = 804 nm）逐渐降低根据pH依赖性吸收、荧光发射光谱和滴定曲线，我们确定Cy 7-Ox的pKa值为1.771。这表明在生理条件下（pH = 7.4），CF的比例略高于OF。
Cy 7通过CF-OF平衡动力学
受Cy 7-Ox中CF-OF动态平衡的启发，我们研究了平衡对Cy 7光稳定性的影响，旨在了解Cy 7-Ox的CF和OF之间的相互作用如何影响整体的光漂白抗性。在三种不同的条件下比较Cy 7-Ox和IR 780在室温加速降解下的吸光度。首先，在300 W钨灯下照射IR 780和Cy 7-Ox的DMSO溶液。虽然IR 780的最大吸光度显著降低，但计算的漂白速率为0.095 min-1，并且最大吸光度在60 min内下降至7.8。与此形成鲜明对比的是，Cy 7-Ox仅以CF形式存在，漂白速率仅为0.002 min-1，最大吸光度保持其初始值的。其次，将两种荧光团的PBS溶液置于300 W钨灯照射下。在此条件下，IR 780的光漂白速率为0.168 min-1，最大吸光度在30 min内下降至5.3%。Cy 7-Ox在428和778 nm处显示两个不同的吸收峰Cy 7-Ox的光漂白速率为0.036 min-1，最大吸光度保持其初始值。第三，将两种荧光团的PBS溶液置于800 nm激光照射下。这种比较是至关重要的，因为Cy 7荧光团在生物成像应用中被NIR激光激发。Cy 7-Ox仍然显示出比IR 780更高的光稳定性。具体地说，Cy 7-Ox的光漂白速率约为IR 780的一半[kbl（Cy 7 Ox）= 0.0043 min-1vs kbl（IR 780）= 0.0094 min-1。此外，在该条件下，Cy 7-Ox的CF表现出延长的光稳定性，并且其吸收光谱即使在激光照射60分钟后也没有改变。恶唑烷的掺入有效地保护了Cy 7染料在上述指定的照射条件下免于光漂白。这些观察结果表明，Cy 7-Ox表现出比IR 780更上级的光稳定性。
在体和超分辨成像过程中的光稳定性
我们评估了Cy 7-Ox在体内和超分辨率成像的光稳定性。Cy 7-Ox表现出膜渗透性，可能是由于其可逆的CF-OF平衡。在活的HeLa细胞内，Cy 7-Ox明确靶向线粒体，这通过使用超分辨率SIM和MitoTracker绿色的共定位分析证实。（Pearson系数为0.956）和CLSM;（Pearson系数为0.935）。Cy 7-Ox的这种选择性靶向归因于阳离子Cy 7与带负电荷的线粒体内膜（IMM）之间的静电吸引。为了进一步评估Cy 7-Ox在细胞内的光稳定性，我们比较了用相等浓度的Cy 7 Ox和IR 780染色的HeLa细胞的荧光强度演变。Cy 7-Ox染色的细胞线粒体荧光信号比IR 780染色的细胞显示出更高的成像对比度和更少的背景这表明可活化的Ox-caged Cy 7作为荧光成像剂即使在没有洗涤步骤的情况下也显著提高了成像质量。在使用640 nm激发激光的20分钟成像期间，与IR 780相比，用Cy 7-Ox染色的细胞内荧光信号显示出明显较慢的强度下降[kbl（Cy 7-Ox）= 0.178 min-1 vs kbl（IR 780）= 0.396 min-1，来自细胞成像的这些结果与我们在基于溶液的研究中的早期发现一致。细胞成像研究的良好结果促使我们在活体小鼠模型中更深入地研究Cy 7-Ox的光稳定性，将相同剂量的Cy 7-Ox或IR 780注射到A549异种移植瘤荷瘤小鼠体内，记录体内和离体荧光生物成像，Cy 7-Ox在活体动物中表现出明显优于IR 780的光稳定性。在NIR光照射下，（680 ± 10 nm激光，200 mW cm-2）照射肿瘤部位后，IR 780的NIR荧光信号迅速出现并逐渐减弱，强调了其有限的光稳定性。另一方面，Cy 7-Ox显示出持续和可辨别的荧光信号。照射0.5 h后，提取小鼠的肿瘤和原代器官以进一步评估Cy 7-Ox和IR 780的荧光强度。荧光成像表明Cy 7-Ox的光稳定性仍然显著高于IR 780的光稳定性。
我们的研究进展到线粒体的超分辨率成像，利用Cy 7-Ox的出色的光稳定性和线粒体特异性。例如，杆状线粒体（由蓝色箭头指示）在6分钟时逐渐彼此接近，并在7分钟时融合。线粒体在10 - 11分钟之间，线粒体（由黄色箭头标记）缓慢分裂成杆状结构。此外，注意到线粒体之间频繁的相互作用。在7分钟时也观察到快速接触，其中分支线粒体（白色箭头）延伸以建立与其他线粒体的接触，并在8分钟时移开。注意到单个分支线粒体内的频繁接触。“在4分钟内与同一区域内的两个地点形成固体接触。这些观察结果强调了线粒体行为，由于Cy 7-Ox的增强的光稳定性而生动地捕获。
总结
我们提出了一种有效的缓冲策略，可以显著提高有机荧光团的光稳定性，以Cy 7为例。通过共价C-O键将Ox-cage整合到Cy 7中，有效地破坏了其π共轭，建立了CF和OF异构体之间的平衡。这种动态平衡在光漂白后连续地消除了Cy 7-Ox的高发射OF形式，与传统的花青荧光团如IR 780相比，为Cy 7 Ox提供了上级“有效”的光稳定性。Cy 7-Ox增强的光稳定性使得能够在活细胞和动物中延长成像持续时间，并且已被证明对于超级荧光团至关重要。
参考文献
Oxazolidine-Caged Heptamethine Cyanine Switch Exhibits High Photostability for Bioimaging via Buffering Fluorogenicity ,Qingkai Qi , Jin Li, Qinglong Qiao *, Chenxu Yan, Mohammad Izadyar , Chao Wang, Syed Ali Abbas Abedi , Xiaogang Liu*, Zhiqian Guo* & Zhaochao Xu1*,CCS Chem. 2025, https://doi.org/10.31635/ccschem.025.202405383
