内容提要
本研究将第二种近红外（NIR-II）多模式光治疗诊断平台与光纤介导的介入光疗策略相结合，实现膀胱癌的全面诊断和“由内而外”治疗。所提出的分子，即BTO-TTQ，通过电子供体/��-桥工程精心设计，并显示出令人满意的具有聚集诱导发射特征的NIR-II发射，光热转换效率高，I型活性氧物种的产生显著。通过量子化学计算和分子动力学模拟，深入研究了激发态的能量耗散途径以及分子内运动对其物理性质的影响，并在近红外荧光-光声-光热三峰成像的指导下，透明质酸修饰BTO-TTQ纳米粒子在光纤介导的介入性光疗中表现出优异的性能，该研究为膀胱癌临床治疗诊断学的上级通用光治疗诊断学的发展带来了新的见解。
AIE 分子的合成与表征
我们开发了一种新的受体核心 ——6,7 - 二（噻吩 - 2 - 基）-[1,2,5] 噻二唑并 [3,4-g] 喹喔啉（TTQ），其具有 2,3 - 二（噻吩 - 2 - 基）吡嗪结构，在受体框架内具有高电子亲和性和增强的 π 共轭，从而强化了分子内的 D-A 相互作用。目前，D/π 桥工程被广泛认为是构建具有显著电子 D-A 相互作用分子的关键策略。尽管基于 TTQ 的分子在 NIR-II 窗口具有良好的发光特性，但在没有强电子供体和 π 桥结构的情况下，实现超过 900 nm 的发射波长仍是一项艰巨的任务。为了突破这一限制，我们根据 D/π 桥工程策略开发了一系列新型 NIR-II AIE 分子，即 B-TTQ、BT-TTQ 和 BTO-TTQ。这些分子以 TTQ 为受体，以 4-（叔丁基）-N-（4-（叔丁基）苯基）-N - 苯基苯胺为强电子供体，不仅具有强大的供电子特性，还因其高度扭曲的分子构型而成为有效的转子。苯环、噻吩和 2,3 - 二氢噻吩并 [3,4-b][1,4] 二氧六环基团分别被用作 π 桥。对 AIE 分子 π 桥结构的精心调整可进一步优化其光物理性质，从而促进其在 NIR-II 多模态光诊疗中的应用，并最终为膀胱癌的进一步诊断和治疗提供更有效的工具。B-TTQ、BT-TTQ 和 BTO-TTQ 通过 Suzuki 偶联、Stille 偶联和酸催化缩合等几步反应合成，产率在 38% 至 74% 之间。通过核磁共振（NMR）和高分辨质谱（HRMS）对关键中间体和最终分子进行了广泛表征。利用紫外 - 可见光谱（UV-vis）和光致发光光谱（PL）研究了这些分子在四氢呋喃（THF）中的光学性质。B-TTQ、BT-TTQ 和 BTO-TTQ 分子的最大吸收波长分别为 654 nm、774 nm 和 724 nm。这表明 BT-TTQ 和 BTO-TTQ 在近红外区域具有良好的光捕获能力。此外，这些分子的最大发射波长分别为 871 nm、1044 nm 和 980 nm，表明它们在 NIR-II 窗口荧光成像（FLI）中的应用潜力。通过检测 THF / 水混合溶剂中不同水体积分数（fw）下的发射光谱，进一步探索了分子的 AIE 特性。在纯 THF 中，由于活跃的分子内运动促进激发态能量通过非辐射衰变快速耗散，所有三种分子的荧光均较弱。然而，随着水分数的增加，BT-TTQ 表现出典型的聚集诱导淬灭（ACQ）行为，当 fw=90% 时荧光几乎完全熄灭。对于 B-TTQ 和 BTO-TTQ，当 fw 从 0% 增加到 50% 时，由于水中的 TICT 效应，荧光显著减弱。当 fw 从 50% 增加到 90% 时，PL 强度急剧增加。值得注意的是，BTO-TTQ 通过引入具有更大空间位阻的 2,3 - 二氢噻吩并 [3,4-b][1,4] 二氧六环单元，有效抵消了水介导的 TICT 效应引起的亮度下降，表现出最强的 AIE 性能。
为了赋予 AIE 分子水溶性和肿瘤靶向能力，我们利用两亲性聚合物 DSPE-PEG2000 通过纳米沉淀技术制备纳米颗粒（NPs）。在水介质中，BTO-TTQ NPs 的紫外 / 可见吸收和 PL 发射光谱相比 THF 溶液中的 BTO-TTQ 分子显著红移，最大吸收和发射波长分别为 738 nm 和 1042 nm。此外，动态光散射（DLS）分析证实 BTO-TTQ NPs 具有优异的单分散性， hydrodynamic 直径约为 75 nm，该尺寸有利于通过增强渗透滞留（EPR）效应在肿瘤组织中积累。透射电子显微镜（TEM）图像显示，BTO-TTQ NPs 呈均匀球形，直径约 60 nm，小于 DLS 报告的 hydrodynamic 直径，可能是由于脱水 TEM 样品表面缺乏水合层。BTO-TTQ NPs 的 PDI 值为 0.267，表明其具有良好的分散性和均匀性。BTO-TTQ NPs 的 zeta 电位测定为 - 30.6 mV，这种负表面电荷有助于增强胶体稳定性并延长体内循环时间。值得注意的是，BTO-TTQ NPs 在水、PBS 或 90% PBS+10% FBS 溶液中储存 7 天，粒径和紫外吸收均无显著变化，显示出优异的稳定性。
随后，评估了 B-TTQ NPs、BT-TTQ NPs 和 BTO-TTQ NPs 的光热性质。观察到这些 NPs 在激光照射（808 nm，0.8 W・cm⁻²，5 min）下温度显著升高。特别是浓度为 100 μM 的 NPs 溶液在照射后温度迅速升高，B-TTQ、BT-TTQ 和 BTO-TTQ NPs 分别达到 32.7°C、73.9°C 和 65.4°C 的平台温度。这种温度变化表明 NPs 聚集态内存在活跃的分子运动。值得注意的是，B-TTQ NPs 水溶液中观察到的最小温度变化可能归因于其在 808 nm 波长处的紫外吸收极小。BTO-TTQ NPs 表现出高达 48.86% 的优异光热转换效率，显著超过 BT-TTQ NPs（31.09%）和大多数先前报道的光热剂。这种显著的温度升高与其扭曲的分子构象和转子结构有关，这将赋予这些 NPs 强烈的分子内运动。使用二氯荧光素（DCFH）作为指示剂进一步评估了这些 NPs 的 ROS 生成效率。在激光照射（808 nm，0.8 W・cm⁻²）下，单独的 DCFH 不产生荧光。有趣的是，在 B-TTQ、BT-TTQ 和 BTO-TTQ NPs 存在下，照射 30 分钟后，DCFH 在 525 nm 处的荧光强度分别增加了 20 倍、65 倍和 75 倍。BTO-TTQ NPs 的 ROS 生成效率显著高于 B-TTQ NPs 和 BT-TTQ NPs。为了进一步区分 ROS 的类型，我们使用单线态氧（¹O₂）指示剂 9,10 - 蒽二亚甲基二丙二酸（ABDA）、羟基自由基（・OH）指示剂羟基苯基荧光素（HPF）和超氧阴离子自由基（O₂・⁻）指示剂二氢罗丹明（DHR123）。结果表明，在激光照射（808 nm，0.8 W・cm⁻²）下，NPs 的 ABDA 吸收随时间变化极小，表明 ¹O₂产生量低。相比之下，HPF 和 DHR123 的荧光强度增加。这表明 BTO-TTQ NPs 可通过 I 型机制高效生成・OH 和 O₂⁻。与 II 型光动力疗法（PDT）相比，I 型 PDT 几乎不依赖氧气。因此，即使在肿瘤微环境的缺氧条件下，BTO-TTQ NPs 仍可通过 I 型 PDT 机制有效生成一定量的 ROS，发挥治疗作用。总之，BTO-TTQ NPs 的优异性能使其成为多模态成像和创新光纤介导介入光疗的杰出候选者。
体外细胞毒性测定与治疗效果
BTO-TTQ NPs 表面修饰的透明质酸（HA）可特异性识别并结合膀胱癌细胞表面高表达的 CD44 受体，有效增强 BTO-TTQ NPs 对膀胱癌的靶向能力和治疗效果。为评估两种纳米颗粒（BTO-TTQ NPs 和 BTO-TTQ NPs-HA）的治疗能力，采用 CCK8 法研究了它们在黑暗和光照条件下对 MB49 细胞（小鼠膀胱癌细胞）的细胞毒性。随着 NPs 浓度的增加，在激光（808 nm，0.8 W・cm⁻²）照射下，细胞存活率显著下降。值得注意的是，BTO-TTQ NPs-HA 在低得多的剂量（75 μM）下表现出比 BTO-TTQ NPs 更高的光毒性。相比之下，即使在 150 μM 的高剂量下，BTO-TTQ NPs 和 BTO-TTQ NPs-HA 的暗毒性均可以忽略不计。此外，两种 NPs 对正常膀胱上皮细胞均无明显细胞毒性，表明它们具有良好的生物相容性，适合进一步的生物医学应用。此外，还采用钙黄绿素 - AM/PI 双染色法验证了 NPs 的光疗效果。在 BTO-TTQ NPs-HA（100 μM）和激光（808 nm，0.8 W・cm⁻²）照射下，几乎所有 MB49 细胞均死亡，表明 BTO-TTQ NPs-HA 比 BTO-TTQ NPs 具有更高的癌细胞杀伤效率。同时，使用 DCFH-DA 作为指示剂测定细胞内 ROS 水平。激光（808 nm，0.8 W・cm⁻²）照射后，当细胞与 NPs 共孵育时，MB49 细胞中可观察到绿色荧光，且 BTO-TTQ NPs-HA 表现出更高效的 ROS 生成。随后，将 BTO-TTQ NPs 和 BTO-TTQ NPs-HA 用异硫氰酸荧光素（FITC）包裹，以可视化 NPs 在细胞中的分布。共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）图像显示，BTO-TTQ NPs-HA 的绿色荧光比 BTO-TTQ NPs 更亮，这归因于 HA 的肿瘤靶向能力。此外，NPs 的绿色荧光与 LysoTracker Deep Red 的红色荧光重叠，表明内吞作用是细胞摄取的途径。上述结果共同表明，BTO-TTQ 是一种有前途的光疗剂，HA 赋予 NPs 更好的肿瘤靶向效率。
体内多模态成像与膀胱癌介入光疗
基于 BTO-TTQ NPs-HA 在体外实验中表现出的优异性能，我们进一步在皮下和原位膀胱肿瘤模型中评估其体内成像和治疗效果。首先，建立皮下 MB49 肿瘤模型，通过尾静脉注射 BTO-TTQ NPs-HA（5 mg/kg），并在不同时间点进行 NIR-II FLI 和 PAI。注射后 6 小时，肿瘤部位可见明显的荧光信号，且信号强度随时间增加，在 24 小时达到峰值，随后逐渐减弱。值得注意的是，BTO-TTQ NPs-HA 的肿瘤 / 正常组织（T/NT）比值在 24 小时达到最高值约 3.5，表明其具有良好的肿瘤靶向能力。PAI 结果与 FLI 一致，注射后 24 小时肿瘤部位的 PA 信号最强。此外，PTI 结果显示，在 808 nm 激光照射下，肿瘤部位温度迅速升高至 55°C 以上，而对照组温度无明显变化。这些结果表明，BTO-TTQ NPs-HA 可作为一种有效的 NIR-II FLI/PAI/PTI 三模态成像探针，用于膀胱癌的精准诊断。为了模拟临床膀胱腔环境，我们建立了气袋型膀胱癌（APBCa）模型。将 BTO-TTQ NPs-HA（5 mg/mL，100 μL）通过尿道导管注入膀胱腔内，30 分钟后进行 NIR-II FLI。膀胱内可见明亮的荧光信号，而未注射 NPs 的对照组无荧光信号。此外，通过光纤将 808 nm 激光（300 mW，10 分钟）直接导入膀胱腔内进行介入光疗。治疗后 24 小时，对膀胱组织进行 H&E 染色和 TUNEL 染色。结果显示，光疗组肿瘤细胞明显凋亡，而对照组肿瘤细胞生长良好。此外，免疫组化分析表明，光疗组 Ki-67 阳性细胞比例显著降低，而 Cleaved Caspase-3 阳性细胞比例显著增加。这些结果表明，BTO-TTQ NPs-HA 介导的介入光疗可有效抑制膀胱癌的生长。
为了评估 BTO-TTQ NPs-HA 的体内安全性，我们对治疗后的小鼠进行了血液学和生化分析，并对主要器官进行了 H&E 染色。结果显示，治疗组与对照组之间的血常规和生化指标无明显差异。此外，主要器官（心、肝、脾、肺、肾）的组织学检查未发现明显的病理损伤。这些结果表明，BTO-TTQ NPs-HA 在体内具有良好的生物安全性。
结论
我们提出了一种引人注目的策略，借助先进的光纤和多模态光诊疗剂，在膀胱癌中实现多模态成像引导的介入光疗。AIE 分子 BTO-TTQ 通过整合多个分子转子、强电子受体和具有显著空间位阻的 π 桥，构建了扭曲的 D-π-A-π-D 分子结构。这种结构巧妙地调节了激发态的辐射与非辐射衰变途径之间的平衡，这可归因于分子转子的存在和显著的扭曲分子内电荷转移。因此，BTO-TTQ NPs 实现了 1042 nm 的峰值发射，展现出增强的 NIR-II 荧光、显著的光声信号、高效的 I 型 ROS 生成以及卓越的光热转换效率（48.86%）。量子化学计算和分子动力学模拟阐明了激发态能量耗散途径和分子内运动对光物理性质的影响，揭示了 AIE 机制背后的理论。
参考文献
Icing on the Cake: Integrating Optical Fiber with Second Near-Infrared Aggregation-Induced Emission Luminogen for ExceptionalPhototheranostics of Bladder Cancer,Jun Zhu, Yiqi Zhu, Jianhong Huang, Weijie Zhang, Jianquan Hou, Ben Zhong Tang, and Dong Wang,Adv. Mater. 2025, 2502452, https://doi.org/10.1002/adma.202502452
