内容提要
本文报告了一种基于主客体相互作用构建的一系列超分子荧光化学计量传感器，用于在神经元和自由活动动物的活脑内对 EP 进行成像和生物传感的探针。优化后的化学计量传感器能够在神经元、脑组织和斑马鱼中以高特异性、高灵敏度、高信噪比和快速动力学（~240 毫秒）对 EP 进行实时成像和定量。更重要的是，我们展示了对自由活动雄性小鼠深脑内 26 个区域的 EP 实时监测，揭示了在恐惧诱导的应激下，杏仁核、丘脑、下丘脑、海马和纹状体中的 EP 浓度升高。这些发现突显了我们的化学计量传感器作为一种强大工具，可在多种模式生物中精确测量 EP 动态。
选择性识别EP的高时间分辨率主客体超分子荧光化学剂量计的设计与合成
建立了用于EP识别的比率超分子荧光化学剂量计，其具有使用主体-客体协同效应的快速响应。（G1、G2和G3）。这些分子（G1-G3）的特征在于设计用于通过缩合反应与儿茶酚型神经递质相互作用的硼酸基团，和活性氟化苯酯，其可通过酯-酰胺交换反应与单胺类神经递质反应26 -28。哌嗪与苯乙烯基吡啶盐荧光团的组合可产生分子内电荷转移效应（ICT），导致荧光强度和量子产率的增强。此外，引入具有不同烷基链长度的连接体以调节构象。具有不同腔尺寸的主体分子CB[n]s CB 6、CB 7、CB 8和CB 10的引入增强了约束效应G1-G3中的吡啶鎓基团和MB中的氮杂环基团使得能够与CB[n]s的空腔自组装。主客体配合物自组装产生超分子荧光化学剂量计。首先，通过荧光滴定，使用具有足够的分子柔性以形成折叠构象的G2作为代表，研究了主体分子对响应性能的影响。四种主体分子大小不同，并且细节包括门直径、腔直径、腔体积，CB的较大空腔尺寸使其能够与芳香族化合物形成1：1二元复合物（CB 7），甚至1：1：1杂三元复合物（CB 8，CB 10）。
当主体分子（CB 6、CB 7、CB 8和CB 10）加入到客体分子G2和MB的混合物中（浓度比= 1：1）时，G2和MB分别在570 nm（F570）和695 nm（F695）处显示荧光发射，在加入CB 8或CB 10后，F570和F695处的发射均发生变化，而加入CB 6或CB 7后没有观察到同时发生变化，表明CB 8和CB 10可以包封两种客体分子，形成超分子荧光化学剂量计CM 8 G2和CMG 2。相应的Job图清楚地表明1：2 CB 8（CB 10）-MB、1：2 CB 8-G2、1：1 CB 10-G2和1：1：1 CB 8（CB 10）-G2-MB结合化学计量，这与先前的报告39，40非常一致。
然后，我们用三种客体分子进行选择性测试。G2和G3未显示出来自各种氨基酸的干扰，但它们被去甲肾上腺素（NE）和多巴胺（DA）显著干扰G1受干扰高达81%，NE受干扰高达61%,G2对NE和DA的干扰分别为47%和37%，G3对NE和DA的干扰分别为56%和44%，随后，检测了相应的化学剂量计对EP的选择性。当与单独的G2相比时，引入主体分子显著降低了EP的选择性。提高了对EP的选择性，其中CMG 2表现出对EP的选择性，
EP特异性识别的最高选择性CMG 2对其他神经递质几乎没有反应，尤其是对NE和DA的干扰显著降低到1.1%和3.2%，而且在竞争试验中，当加入潜在干扰物时，测定EP时没有明显的荧光变化（其它氨基酸，碳水化合物，金属离子和活性氧）。通过使用快速混合停流技术测量探针的感测反应的荧光响应动力学，其中有限混合时间小于8 ms。发现F570处的荧光强度在加入EP后立即降低，并在不同时间达到平台，其中序列为G2（1.91秒）<G3（2.52秒）<G1（2.92秒）。G1-G3对EP的反应速率常数（kobs）值分别为9.83×10−4 ms−1、3.98×10−3 ms−1和1.87×10−3 ms−1，表明EP和客体分子之间的快速响应。
CMG 2对EP的荧光滴定及机理探讨
CMG 2测定EP的工作原理，在CMG 2的缓冲溶液中加入EP进行荧光滴定实验，F570通道（从505 - 645 nm收集）随EP浓度的增加而急剧下降，当加入12.0 μM EP时几乎达到最小值，而F695通道（从665至750 nm收集）保持不变CMG 2的相对荧光强度显示出良好的线性相关性。在0.02 ~ 12.0 μM范围内，线性关系良好（R2 = 0.9943），回归方程为F570/695 = 3.965 - 0.166 [EP] μM。检测限（LOD）估计为5.1 ± 0.3 nM（n = 5，S.D.）。根据公式（1）和（2），计算CMG 2与EP之间的结合亲和力。估计的结合亲和力为4.66×104 M−1。其中，[H]0是用于滴定的CMG 2的总浓度，[G]0是用于滴定的EP的总浓度，Ka是缔合常数。CMG 2在缺乏（<1.3%）或存在在480 nm照射8 h时，EP（<1.9%）。在不存在下，F570/F695没有显著变化。在6.0-10.0的pH范围内检测到EP的存在（<1.5%）或存在（<2.1%）
为了使加入EP后CMG 2的发光变化合理化，在PBS缓冲溶液中，在480 nm激发下，初步研究了CMG 2 + EP的荧光寿命，观察到CMG 2 + EP的平均荧光寿命当与原始CMG 2相比时，在添加EP后增加（2.486 ns还研究了飞秒瞬态吸收（fsTA）测量，揭示了CMG 2的两种不同的激发态：局部激发态S1（LE）和分子内电荷转移态S1（ICT）。与EP反应后，由于硼酸酯结构的形成，LE态向ICT态的弛豫被抑制。这种变化导致ICT/LE弛豫比从0.78移动到0.17，导致CMG 2在570 nm处的荧光猝灭。
神经元、脑组织和斑马鱼中EP的荧光成像和实时定量
为了将CMG 2应用于生物系统中EP的成像和生物传感，通过流式细胞术（FACS）分析和MTT测定来评估CMG 2的生物相容性和细胞毒性。在与浓度增加的CMG 2孵育后，活神经元的存活率保持在90.7%（0、10、30和50 μM）24 h，显示出良好的生物相容性。MTT测定也显示出神经元的高活力当与不同浓度的CMG 2孵育时，（0、10、20、30和50 μM）24 h，表明细胞毒性较低这些结果表明CMG 2具有良好的生物相容性和低细胞毒性。此外，CMG 2可以在体内保持长达24小时的光稳定性，确认其对于成像应用的适用性。用荧光成像技术检测细胞膜EP反应动力学用CMG 2和商业膜染料Dio共染色神经元30分钟显示CMG 2和Dio的F570通道的荧光信号之间的强重叠，具有0.96的高Pearson相关系数，表明了优异的神经元细胞膜靶向能力。我们假设阳离子吡啶鎓与细胞膜表面的磷酸根阴离子具有静电亲和力，而疏水烷基链可以嵌入细胞膜，有助于细胞膜靶向能力，CMG 2的荧光信号在细胞膜上保持稳定（<8.5%）48 h，满足细胞实验的要求，与细胞孵育72 h后，CMG 2在细胞膜上的靶向降低，表明探针被代谢出细胞。
当与PBS组相比时，施加饱和浓度的EP诱导的荧光降低了CMG 2，证明了神经元细胞中的荧光响应。我们进一步使用CMG 2来研究外部电刺激后神经元中的EP响应动力学。我们首先进行对照实验以排除荧光响应是由于化合物的电化学活性的可能性。3 V正弦波（1.0 s），并监测荧光强度，其保持不变。此外，溶液的NMR和MALDI-MS分析显示CMG 2在外部电压后没有结构变化。在用电刺激治疗后，（20 Hz，3 V，正弦波1.0 s），荧光强度在~5.0 s内显著降低，表明在神经元细胞膜上EP的快速增加定量分析进一步证实了这一现象，显示电刺激后4.0 s内EP浓度从0.09±0.02 μM增加到3.16±0.07 μM。经PBS缓冲液处理后，细胞膜中EP浓度几乎保持不变。因此，我们的超分子荧光化学剂量计成功地实现了神经元中EP反应的监测，允许以精确的细胞膜靶向和快速的时空分辨率定量检测EP浓度。
随后，我们使用CMG 2在脑组织和斑马鱼中进行成像研究。我们制备了正常小鼠四个不同区域的急性脑组织切片，包括初级躯体感觉皮层（S1 BF）的氨角（cornu ammonis）、海马（CA 1）、尾壳核（Cpu）和丘脑背外侧核（LD）。在这些脑区域中进行了EP的实时成像和定量生物传感。EP的浓度在20 Hz的电刺激下表现出增加。F570/F695通道的平均荧光比率在特定的时间范围内显著变化：LD在5.1 s内由3.74 ± 0.14升至3.52 ± 0.12; CPU在4.9 s内由3.56 ± 0.09升至3.24 ± 0.06。然而，在S1 BF中观察到EP的最小变化，比值从3.87 ± 0.13变化至3.80 ± 0.10这些结果表明，与S1 BF相比，EP对CA 1、Cpu和LD中的电刺激更敏感。，表明响应于电刺激，F570/F695的值在7.8 s内从3.88 ± 0.10变为2.94 ± 0.13。相反，在PBS缓冲液处理后，斑马鱼中的EP浓度保持相对恒定结果突出了所开发的化学剂量计的优异成像能力，具有对EP的高选择性和快速响应速度。
总结
我们报道了一种基于主客体相互作用的超分子荧光化学剂量计，该化学剂量计可用于实时成像和定量分析EP动力学。我们合成并表征了一系列化学剂量计。优化的CMG 2可用于体外和体内监测EP活性，具有高亲和力，高灵敏度，和快速动力学（~240 ms）。我们能够证明CMG 2在神经元、脑切片和斑马鱼中检测电刺激后的EP动力学。值得注意的是，我们成功地监测了快速的EP反应，并通过精确的细胞膜靶向和毫秒-并利用自制的多通道光纤荧光光谱系统对自由行为小鼠脑深部26个不同区域的EP进行了实时监测。我们观察到恐惧应激小鼠杏仁核、丘脑、下丘脑、海马和纹状体内EP浓度较正常小鼠增加，为实时监测EP浓度、分布和从神经元到全脑的动态变化开辟了新的途径。这有助于我们了解EP的生理和病理过程，本工作进一步提供了一种设计和合成化学剂量计的方法，用于特异性和灵敏地测定神经元中的神经递质、氨基酸和蛋白质，组织和小鼠大脑。
参考文献
Molecularly engineered supramolecular fluorescent chemodosimeter for measuring epinephrine dynamics,Yudan Zhao, Yuxiao Mei , Zhichao Liu, Jing Sun & Yang Tian,Nat.Commun. | (2025) 16:1848,https://doi.org/10.1038/s41467-025-57100-5
