内容提要
本文将白蛋白特异性标记的近红外-II（NIR-II）探针设计为发色团，用于原位构建荧光蛋白（FPs），用于评估脑卒中中的BBB破坏。白蛋白通过紧密夹持效应有效地充当发色团的亮度增强剂和稳定性调节剂。和蛋白质突变技术来研究白蛋白和发色团之间的结合行为。原位NIR-II FP构建策略有助于在缺血性卒中期间与IR-II FP结合时对BBB破坏和脑血管进行高精度双通道成像。
白蛋白标记染料Cn-1080的合成
受传统荧光蛋白结构的启发，我们从仿生学角度提出了基于蛋白质标签的原位构建NIR-II FP的策略，根据我们之前对染料结构与外源性白蛋白结合能力的研究，选择1080染料骨架结构作为候选发色团构建原位NIR-II FP;随后，通过使用分子侧基工程策略优化Cn-1080染料的结构，以筛选具有优异光学性质和高效白蛋白标记性质的最佳NIR-II发色团。，NIR-II亮度、UV吸收和荧光数据一致地证实羧基侧链的长度直接影响Cn-1080染料的光学性质。与其他侧链染料分子相比，C7-1080染料分子表现出最佳的NIRII亮度和光稳定性，远远上级临床批准的ICG探针。
NIR-II荧光蛋白的体外构建与鉴定
我们之前的工作已经揭示氯化花青染料可以通过亲核取代反应有效地共价嵌入白蛋白的疏水口袋中，以形成仿生NIR荧光蛋白。白蛋白作为外壳可以显著抑制由内部旋转/振动引起的非辐射跃迁，从而大大提高NIR染料分子的亮度。这些FP的构建通常需要体外干预，例如加热或添加催化剂，这在体内难以自动完成。为了解决这一挑战，我们选择HSA溶液作为模拟体内环境，并试图在没有外部干预的情况下从Cn-1080系列染料中鉴定有效的原位白蛋白标记染料，从而实现荧光蛋白的体内构建。根据在各种反应条件下Cn-1080染料与HSA结合后的NIR-II亮度和凝胶电泳数据，我们惊讶地发现C7-1080染料表现出最佳的白蛋白结合能力和荧光增强，特别是在生理白蛋白浓度（5%HSA）下。同时，采用高分辨质谱（HRMS）数据进一步分析具有不同侧链的Cn-1080染料的共价结合，与上述结果一致，C7-1080染料显示出对白蛋白的最大共价结合亲和力，超过其它Cn-1080染料。
Cn-1080染料与人血清白蛋白结合行为的分析
为了阐明具有不同侧链长度的Cn-1080染料分子与HSA之间的结合差异的机制，首先进行了各种环境下Cn-1080染料的DLS粒度分析。结果显示，由于“H”聚集诱导的行为，Cn-1080染料容易在水溶液中形成非均相体系，然而，HSA的引入有效地调节了纯染料分子的聚集行为，HSA与短侧链的Cn-1080染料（n ≤ 8）迅速形成非共价复合物，特别是在加热反应后，HSA与Cn-1080染料更倾向于形成共价复合物。值得注意的是，较长侧链的缠结效应进一步促进加热后Cn-1080染料（n ≥ 10）和HSA之间形成均匀且大尺寸的纳米颗粒。这一现象有效地说明了侧链的长度在调节白蛋白与染料分子的结合行为中起着至关重要的作用。
原位近红外荧光蛋白对血脑屏障破坏的近红外靶向成像
由于C71080染料和白蛋白之间建立了可靠的相互作用，不仅可以直接观察白蛋白渗漏，而且还可以在中风期间精确定位BBB破坏。我们成功建立了小鼠左侧大脑皮层中具有类似梗死区域的光血栓性中风（PTS）模型。在模型成像之前，首先从静脉注射C7-1080染料的小鼠中收集血液，以验证体内NIR-II FP的形成和药代动力学。血液亮度、凝胶电泳和蛋白质染色有效地证实了体内荧光蛋白的形成，具有持续的体内循环期，从而为BBB破坏的靶向成像奠定了初步基础。随后，我们应用C7-1080作为原位白蛋白标记染料进行血脑屏障破坏成像研究，荧光信号在卒中区域逐渐积聚，与假手术组相比，早在10分钟就检测到渗漏，表明其通过受损的血脑屏障浸润到脑实质中。白蛋白逃逸近红外探针IR-808 Ac由于其快速的肝脏清除和短的循环时间而不与白蛋白共价结合，因此未能成像脑卒中中的BBB破坏。此外，我们通过调节光致血栓形成时间来模拟不同程度的中风，以评估C7-1080染料监测血脑屏障破坏的灵敏度。令人鼓舞的是，C7-1080染料在轻度症状中风模型中仍然表现出优异的BB B破坏检测我们还比较了NIR-II BBB破坏成像技术与常用的PTS模型表征方法，TTC和EB染色区域与近红外基本一致-这些结果表明，基于PTS方法的脑缺血性中风引起BBB损伤/破坏，导致血浆组分外渗到脑实质中。我们还发现体外构建的荧光蛋白（HSA@C7-1080）在尾静脉注射后未显示出理想的BBB破坏成像能力，上述现象有效地表明，C7- 1080染料是其实现血脑屏障破坏敏感、特异成像的直接原因。
总结
基于分子侧基工程策略，我们在概念上验证并提出了一类具有明亮的近红外-II发光和白蛋白特异性共价标记能力的染料分子（Cn-1080）作为近红外-II发色团用于原位构建荧光蛋白，体外/体内实验证明C7-1080发色团可以与白蛋白实现位点特异性共价结合本研究采用理论模拟、蛋白质组学和蛋白质突变等技术，对白蛋白与发色团的结合行为进行了深入研究，并对白蛋白与发色团的结合机理进行了初步探讨，特异性结合位点被鉴定为DIIIa结构域上的Cys 477。更重要的是，由发色团和白蛋白之间的可靠相互作用产生的原位NIR-II FP不仅提供了白蛋白渗漏的直接可视化，而且还能够对缺血性中风期间的BBB破坏进行高精度成像。实时双-通过与白蛋白逃逸IR-800 Ac探针的有效结合，还实现了BBB破坏和脑血管的通道成像，从而提供了对缺血性卒中机制的深入了解。所提出的原位荧光蛋白构建策略有望解决NIR-II FP当前局限性中的重要空白，并为中风相关疾病的研究开辟新的机会。
参考文献
NIR-II Fluorescent Protein Created by In Situ Albumin-Tagging for Sensitive and Specific Imaging of Blood-Brain Barrier Disruption,Jiajun Xu,* Yijing Du, Ningning Zhu, Jia Li,* Yuewei Zhang, Ding Zhou,* and Shoujun Zhu*,Adv. Sci. 2025, 12, 2500443,https://doi.org/10.1002/advs.202500443
