内容提要
本文介绍了一种通过在NIRII菁的末端结构上进行简单的供体异位取代来增强HOMO-LUMO分离从而扩展发射波长的新策略，与原始的NIR-II菁Flav 7相比，这些新染料（NIR-AC）表现出显著的发射红移和更大的Stokes位移，最大发射波长超过1300 nm（NIR-IIa），尾发射超过1500 nm（NIR-IIb）。它们在体内成像中还表现出优异的稳定性和更深的组织成像能力。
在过去的十年中，近红外-II成像技术的进步刺激了各种近红外-II小分子荧光团的发展。在这些染料中，花青染料特别值得注意。其特征在于由两个杂环端基包围的中心共轭次甲基链，它们提供了独特的优势，例如简单的合成，特别高的摩尔消光系数（ε > 105 M−1 cm−1），以及调谐到更长波长的能力。
我们在七甲川骨架的4'位引入给电子基团的新型黄鎓衍生物可以构建稳定的、长波长、高亮度的、用于生物成像的近红外-Ⅱ菁（称为NIRACs），其在黄酸的4 '-位封端不同的烷基胺对于对照，还合成了NIR-II花青染料Flav 7和Flav 9，Flav 9是直接延长Flav 7的次甲基链的九亚甲基花青。所有新型NIR-AC染料都表现出NIR-II发射，并且它们的光谱最大值跨越1132 nm至1328 nm，以及良好的量子产率（0.024%-0.136%）。与著名的7位二甲氨基封端的基于黄钥的七甲基花青Flav7相比，（λabs/λem = 1026/1045 nm），黄铵4 '位二甲氨基修饰的染料NIRAC 1作为同分异构体，其吸收和发射光谱均发生明显红移（λabs/λem = 1090/1132 nm），这与九亚甲基花青染料Flav9（λabs/λ em = 1122/1140 nm）相当。通过给电子氨基的4 '位异位取代，可以得到发射波长更长的NIR-Ⅱ型七甲基花菁染料，如果我们提高黄环上4'位取代基的给电子能力，染料NIR-AC 3的吸收/发射波长（吡咯烷修饰）和NIR-AC4（用融合氨基修饰）进一步延伸，分别达到1107/1178 nm和1149/1206 nm。在黄环B和C之间限制旋转的NIR-AC 2也表现出吸收和发射波长的红移（λabs/λem = 1126/1176 nm），但量子产率和摩尔吸光系数低于NIR-AC 1。这可能是由于单键苯环的旋转自由度降低。对于量子产率，我们认为它不仅仅取决于NIR-Ⅱ花青染料中苯环的旋转自由度。18 a，此外，值得注意的是，如果我们将端基从黄铵改变为硫代黄铵，则染料NIR-AC 5的吸收/发射波长（1177/1256 nm）和NIR-AC6（1196/1308 nm）可以进一步扩展。具有4'-融合-氨基取代的硫杂夫铵的NIR-AC 6在1300 nm以外表现出最大发射峰。这是具有七甲川骨架的发射最长NIR-II的黄鎓基染料，是一种很有前途的NIR-IIa和NIR-II造影剂。
当我们仔细观察NIR-AC 1和NIR-AC 4的电子结构时，NIR-AC 4的A环上的约化LUMO电子云分布（红色箭头）和更多的HOMO电子云分布在C环上观察到该结果表明，取代基的增加的供电子能力可以增强NIR-AC的HOMO-LUMO分离程度。还应该注意到与JuloFlav 7向Flav 7的35-nm红移相比，染料NIR-AC 4相对于NIR-AC 1具有76 nm的波长红移该数据表明HOMO-LUMO分离是实现NIR的大波长红移的关键点。所有这些数据表明，给电子基团对黄鎓的4'异位取代可导致七次甲基菁染料的HOMO-LUMO分离和ICT增强，从而产生更长的NIR-II发射并增加斯托克斯位移。
我们测定了小鼠中NIR-AC的脑血管成像能力。由于其最长的NIR-II发射波长，选择NIR-AC 6作为对小鼠脑和后肢成像的实例。在1120 nm激光激发下，NIR-AC 6纳米粒子无论在NIR-IIa窗口还是在NIR-IIb窗口都能很好地分辨出小鼠体内的微小血管，而在相同的收集通道下，Flav 7和Flav 9在活体小鼠体内的成像不清晰，这主要是由于Flav 7和Flav 9的发射波长较短，导致NIR-IIa和NIR-IIb范围内的发射强度较弱。此外，小的斯托克斯位移也会导致其NIR-II荧光猝灭。这些结果验证了供体异位取代策略延长NIR-II七甲基花青波长的有效性，为体内NIR-IIa和NIR-IIb成像做好准备。此外，血管的横截面强度曲线显示，NIR-AC 6的NIR-IIb成像具有比其NIR-IIa成像更高的SBR和更小的FWHM，证明了NIR-IIb成像的更高对比度和分辨率。考虑到其高QY和稳定的NIR-II发射，（λabs/λem = 1149/1206 nm; QY = 0.063%），我们还研究了NIR-AC 4 NP用于体内NIR-IIa或NIR-IIb成像的适用性，尽管显示出比NIR-AC 6 NP更短的发射，（λem = 1308 nm），NIR-AC 4 NP在NIR-IIa或NIR-IIb窗口中表现出与NIR-AC 6 NP相当的成像性能，并且可以长期监测脑血管。
我们将NIRAC 4纳米粒子应用于NIR-IIb子窗口的肿瘤追踪，为了增强纳米探针的肿瘤识别和富集能力，在PEG上引入肿瘤靶向基团生物素，制备NIRAC 4 Bio-NPs，注射12小时后，NIR-AC 4 Bio-NP可以显著照亮肿瘤部位，与小鼠的正常皮肤组织形成鲜明对比。没有生物素修饰的纳米探针NIR-AC 4 OMe-NPs在肿瘤部位显示出低得多的累积NIR-II信号。即使纳米探针的注射时间延长至24小时，NIRAC 4 OMe-NPs组中的肿瘤与正常组织（T/NT）比率也仅为~6。然而，在同一时间点，NIR-AC 4 Bio-NPs组在NIR-IIb窗口中显示15倍的T/NT比值。这上级一些基于PD-L1的NIR-II探针。考虑到其高QY和稳定的NIR-II发射，（λabs/λem = 1149/1206 nm; QY = 0.063%），我们还研究了NIR-AC 4 NP用于体内NIR-IIa或NIR-IIb成像的适用性，尽管显示出比NIR-AC 6 NP更短的发射，（λem = 1308 nm），NIR-AC 4 NP在NIR-IIa或NIR-IIb窗口中表现出与NIR-AC 6 NP相当的成像性能，并且可以长期监测脑血管。
值得注意的是，与具有类似吸收的参比染料Flav 9相比，（λabs/λem = 1122/1140 nm），NIR-AC 4 NPs在小鼠肿瘤血管中表现出显著增强的SBR，尤其是在NIR-IIb区域这可归因于NIR-AC 4比Flav 9具有更大的斯托克斯位移和更高的稳定性，上述结果表明，NIR-AC 4在体内NIR-IIb成像中具有巨大的潜力，同时也再次证明了供体异位取代策略在开发具有稳定和延长发射的NIR-II菁染料用于NIR-IIb生物成像中的有效性。
鉴于骨骼中的高钙离子环境，我们用磷酸盐基团修饰纳米探针的表面，以增强其对骨骼的靶向能力，并获得均匀尺寸和长期稳定的阿仑膦酸（Aa）NP。通过将阿仑膦酸钠共价接枝到NIR-AC 4 COOH-NPs表面，制备的纳米探针NIR-AC 4 Aa-NPs在尾静脉注射24小时后可以对小鼠骨骼进行高对比度成像。相比之下，包装在普通PEG中的探针NIR-AC 4 OMe-NPs只能获得模糊的图像。即使在去除皮肤后，NIR-AC 4 OMe-NP在NIR-II窗口中不能清楚地区分小鼠骨骼和其他组织。骨骼的横截面强度曲线表明，与NIR-AC 4 OMe-NP相比，NIR-AC 4 Aa-NP还可以区分棘突和椎体，具有更高的SBR和更清晰的特征完整性这些数据证明阿仑膦酸盐确实可以增加NIR-AC 4 NP对小鼠骨的亲和力，并且NIR-AC 4 Aa-NP是用于体内骨成像的有用探针。值得注意的是，我们发现与1500 LP相比，使用1300 LP实现更好的骨成像性能这可能是由于骨表面的致密结构能够消除部分吸水引起的干扰。体内结果，对来自注射NIR-AC 4 Aa-NP的BALB/c小鼠的分离的骨组织进行成像。在去除皮肤、内部器官和主要组织后，使用在NIR-II窗口中配备有高倍成像透镜的NIR-II成像系统对不同解剖位置处的骨切片进行详细成像。可以清楚地看到，探针NIR-AC 4 Aa-NPs清楚地显示了小鼠颅骨和上颌骨、胸椎和肋骨、骶椎和尾椎;甚至棘突和横突在图像中也是可见的。此外，股骨，胫骨，髌骨，趾骨，还描绘了小鼠的跖骨和尾椎骨。这些结果充分证明NIR-AC 4 Aa-纳米颗粒可以特异性结合整个骨骼系统，突出了其在骨相关疾病早期诊断中的潜在用途。
总结
我们提出了一种新的策略，通过供体异位取代巧妙地操纵末端基团的分子结构，实现增强的HOMO-LUMO分离，并显着延长对称花青的波长。遵循这一策略，我们通过简单的2-甲基环化反应合成了一系列最大发射波长超过1300 nm，尾发射超过1500 nm的近红外Ⅱ型七甲川菁染料。该方法有效地填补了NIR-IIa/B成像区有机荧光团的不足。
与其他长波长菁染料IR 26和Flav 9相比，这些NIR-AC显示出优异的稳定性和抗光漂白性。由于延长的发射和斯托克斯位移，它们还显示出显著增强的深层组织成像能力，这对于动态生物过程的体内跟踪至关重要。同时，这些NIR-AC固有的生物相容性和可调谐性使它们成为常规NIR-IIa/B无机成像剂的适应性和更安全的替代物。生物素修饰的和阿仑膦酸钠官能化的NIR-AC纳米颗粒，分别命名为NIR-AC 4 Bio-NPs和NIR-AC 4 AaNPs，对肿瘤和骨组织表现出更高的亲和力。它们支持靶向癌症成像，并能够在NIR-IIa/B窗口中实现骨结构的高分辨率、无辐射成像。此外，NIR-ACs NPs有助于以最小的信号串扰进行多路复用成像，总之，本研究为NIR-IIa/B有机染料的开发提供了一种新的策略，引入了非常有前途的多功能荧光团，这为深部组织生物医学成像的非侵入性诊断技术提供了许多新的机会。
参考文献
Constructing Stable and Wavelength-Extended Heptamethine Cyanines via Donor Ectopic Substitution for NIR-IIa/b Bioimaging,Yi-Feng Ou, Hong-Ya Xiang, Xu Yang, Ren-Xuan Wang, Shuang-Yan Huan, Lin Yuan, Tian-Bing Ren,* Xiao-Bing Zhang,Angew. Chem. Int. Ed. 2025, e202423978,https://doi.org/10.1002/anie.202423978
