内容提要
小分子有机荧光团，在900-1700 nm范围内具有光谱活性，具有可调谐波长和传感特性的荧光染料（CX）被开发用于活体光学成像和生物传感。CX染料具有花菁染料的波长可调谐性，并具有刚性的多甲川链以保证其稳定性。它们是化学和光致发光染料。CX染料的光致发光特性和荧光光谱特性是CX染料的重要组成部分。CX染料在水溶液中稳定，具有可调的光学性质，其最大吸收/发射波长为1089/1140 nm，在高对比度的体内生物成像和荧光检测中显示出巨大的潜力，光学串扰可以忽略不计。本报告介绍了一系列具有高对比度生物成像和多路生物传感的光谱特性的近红外-II染料。
CX染料通过化合物1和亲电试剂2、3或4之间的一步缩合反应以良好的产率合成，产率范围为51%至61%。CX-1、CX-2和CX-3在CHCl 3中的最大吸收/发射波长分别为883/ 920 nm、981/1032 nm和1089/1140 nm。当共轭链增加两个碳原子时，吸收和发射波长均发生了约100 nm的红移，摩尔消光系数约为1 × 105 cm ~（@1m）它们在极性非质子溶剂氯仿中的荧光量子产率分别为0.66：0.03%、0.45：0.02%和0.091：0.014%。我们测量了CX染料和菁染料在氯仿和水溶液（50%MeCN）中的光谱，与它们在氯仿中的吸光度相比，CX染料在水溶液中的吸光度下降了7-62%，IR 26下降了91%。同时，在用氯仿萃取后，CX染料可以在水溶液中回收，但IR 26不能。评估了CX染料对生物亲核体和活性氧的化学稳定性。在加入谷胱甘肽、半胱氨酸、硫化氢、过氧化氢、过氧亚硝酸盐或次氯酸盐（OCl-）至其相应的生理浓度时，没有观察到CX染料（10 mm）在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中的明显光谱变化。以CX-1为例，吸收光谱保持不变，除非pH高于12或低于3。
我们用CX-2对裸鼠的淋巴引流进行荧光成像。用于成像的所有CX染料都装载在胶束中。CX-2是NIR-II区域中最亮的CX，在裸鼠后爪皮内注射CX-2后10分钟获得荧光图像。从高放大率的图像中，后肢踝关节至少有三条侧支淋巴管清晰分辨，侧支淋巴管的横截面强度轮廓显示最大特征分辨率这些结果清楚地表明CX染料是用于体内成像的理想NIR-II荧光成像剂。在淋巴引流成像中，通过在稳定的NIR-II信号时间窗内连续激光照射来验证CX染料的体内光稳定性，在长时间激光照射后，血管和淋巴结仍然可以清楚地区分（965 nm，50分钟）。相比之下，在相同的能量密度下，808 nm激光照射ICG 6分钟后，ICG几乎完全光漂白。值得注意的是，淋巴结的信号在照射后20分钟内恢复，这一结果进一步证实了CX染料比ICG染料具有更好的光稳定性，有利于体内荧光成像。
CX染料的多波长可调谐性和良好的稳定性的优点促使我们探索其在体内荧光成像中的潜力。将CX-1、CX-2和CX-3负载到胶囊中，并并排放置在培养皿下。利用不同的激发波长和相应的滤光器，在高达4 mm的组织深度处可以清楚地区分这三个毛细血管。接下来，我们对离心管中CX染料的混合溶液和单独溶液同时成像，成像结果证实混合溶液的信号与相应染料的信号一致，这排除了CX染料之间的光学串扰在血管造影成像过程中。体内图像是在尾静脉注射CX染料后立即采集的。对于重叠的成像区域，可以清楚地区分三个光学通道，这使我们能够探测深部组织并获得多路复用信息。NIR-II窗口中的荧光成像使我们能够以更高的分辨率探测深层组织，迫切需要实现深层组织生物传感。由于发射和吸收光谱包含重叠特征，我们试图研究CX染料之间FRET对NIR-II荧光的可能操纵。含有CX 1和CX-3或仅含有CX-1或CX-3的胶束CX-3在808 nm激光激发下，荧光强度增强，而CX-1的荧光强度减弱，表明CX-1和CX-3之间发生了有效的FRET反应。并且结果与它们在高达4 mm深度的发射光谱一致。
在目前的工作中，我们发现CX-1在存在OONO-的情况下比CX-3稳定得多，CX-1和CX-3对OONO-的反应性和反应速率有明显差异，当OONO-浓度为0.00000 μ g/ml时，CX-1对OONO-的反应速率远低于CX-3例如，当OONO-的浓度为10 mM时，CX-1和OONO-之间的反应的初始速率（r 0）为约0.88 μ mol/L，而CX-3的r 0为3.34 μ mol/L。我们进一步研究了PN 1100对裸鼠肝脏的毒性作用，以APAP处理的裸鼠为模型，将雌性裸鼠随机分为PBS组、APAP组和APAP + N-乙酰半胱氨酸组（NAC，用于治疗对乙酰氨基酚过量的药物），分别记录注射PN 1100后不同时间肝脏的950 nm长通（LP）和1100 nm LP荧光信号。1100 LP清楚地表明，在APAP处理的小鼠的肝脏中产生了OONO-，因为其比例明显高于PBS处理和补救的小鼠（APAP + NAC）组。APAP处理的小鼠中的5-10 mM的OONO-浓度基于比率信号计算，可以检测到（300 mg/Kg）。最后，我们进行了组织学分析（苏木精和伊红染色（H&E））。在APAP治疗组中观察到不均匀的肝细胞形态和炎性细胞的浸润（箭头2）。在NAC治疗组中观察到显著改善的症状，但仍可见少量炎性细胞浸润，提示NAC能有效抑制APAP诱导的肝损伤，组织学结果与活体荧光成像结果一致。
总结
CX系列有机荧光团可用于高达4 mm组织深度的体内荧光成像。此外，通过调节CX染料的波长，其响应于OONO-表现出可靠的信号变化，并成功应用于APAP诱导的肝毒性的体内检测。我们认为，近红外-荧光共振能量转移（FRET）技术在深部组织中的应用将成为近红外-Ⅱ荧光传感器设计的一般策略。此外，CX染料具有良好的光谱特性和易于合成的特点，可用于基于光谱的生物医学和材料应用。
参考文献
Stable, Wavelength-Tunable Fluorescent Dyes in the NIR-II Region for In Vivo High-Contrast Bioimaging and Multiplexed Biosensing,Zuhai Lei, Caixia Sun, Peng Pei, Shangfeng Wang, Dandan Li, Xin Zhang, and Fan Zhang,Angew. Chem. Int. Ed. 2019, 58, 8166 –8171,DOI: 10.1002/ange.201904182
