内容提要
（NIR-II，1000 - 1700 nm）以聚集诱导发射（AIE）和具有特异性靶向能力的细胞膜为特征的光疗诊断剂，我们开发了一种用于肺结核（TB）精确光治疗诊断的多功能仿生纳米颗粒（NP）。将光治疗诊断剂与预活化的巨噬细胞膜包被导致形成仿生NP，其通过病变-病原体双靶向策略表现出对TB的特异性结合，允许通过NIR-II荧光成像和使用1,064 nm激光照射的精确光热治疗来精确检测结核分枝杆菌。与传统治疗相比，单个小肉芽肿（直径0.2 mm），并且在NP给药后实现了改善的抗菌效果。我们提出了合成NIR-II AIE试剂的标准化工作流程，它们用于制造仿生NPs的用途以及它们作为抗结核分枝杆菌的光治疗诊断剂的体外和体内应用。NIR-II AIE试剂的制备和表征需要~8 d，光治疗诊断NPs的合成和表征需要~8 d，体外靶向能力和光热根除的验证需要~26 d，而体内NIR-II荧光成像和成像引导的光热治疗需要~74 d。所有程序都很简单，适合于具有有机合成和生物医学工程先前培训的临床医生或研究人员。
方案设计
我们将NIR-II AIEgens与预活化的巨噬细胞膜（PM）结合，制备了仿生BBTD@PM纳米粒（BBTD，苯并双噻二唑）用于TB 45的靶向诊断和治疗BBTD@PM纳米颗粒由（1）1064 nm激光可激发聚集诱导发射（AIE）分子组成（TPE-BT-BBTD）（TPE，四苯乙烯; BT，苯并[c]噻吩），用于同时进行NIR-II FLI和PTT;（2）食品和药物管理局批准的生物相容性和可生物降解的共聚物聚（乳酸-羟基乙酸共聚物）（PLGA）以负载TPEBT-BBTD;和（3）用于靶向递送的预活化巨噬细胞膜。制造过程包括制备含有TPE-BT-BBTD的PLGA核心，然后与海分枝杆菌刺激的巨噬细胞膜共挤出以形成BBTD@PM NP。在1064 nm激光照射下，BBTD@PM NPs显示出约1300 nm的峰值荧光发射，在NIR-II窗口中对于光疗诊断剂具有稳健的光热加热效应和优异的光热稳定性。由于TB相关Toll样受体（TLR）的上调，通过蛋白质印迹（WB）分析验证，与其他对照组相比，BBTD@PM NPs表现出对分枝杆菌属物种的特异性靶向和优异的抗菌效果。在H37 Ra诱导的肺TB小鼠模型中，以高分辨率完成了结核性肉芽肿的FLI（1500 - 1700 nm）。BBTD@PM NP的光热杀伤作用有效地消除了结核分枝杆菌并减少了病理损伤和炎症。我们提出了一个方案来说明用于制造BBTD@PM NP的精炼和标准化程序，包括TPE-BT-BBTD的合成，巨噬细胞的预活化，提取预处理的巨噬细胞膜并共挤出以产生最终的BNP我们还描述了BBTD@PM NP体外靶向能力的验证，并将这些NP应用于肺TB的NIR-IIb FLI和成像。值得一提的是，通过特定的改变，以其高治疗诊断性能和特异性靶向能力而闻名的NIR-II AIE BNP可以扩展到治疗本方案范围之外的其他病原体相关疾病。
与其他方法相比
除了传统的化学疗法外，还有其他治疗结核病的方法，例如免疫疗法、光动力疗法和经皮肺结核疗法。卡介苗是唯一获准用于结核病免疫疗法的疫苗;它主要有效预防儿童结核病，但对成人的疗效有限。光动力疗法是根除结核分枝杆菌的一种潜在战略;然而，TB肉芽肿内的缺氧条件严重限制了其有效性。或者，PTT使用光吸收材料在激光照射时产生热量，证明了有效杀死分枝杆菌而不诱导耐药性的潜力。最近，几种传统的光热纳米材料，包括介孔多巴胺NPs，普鲁士蓝纳米颗粒和金化合物已被探索用于结核病治疗。然而，由于辐射和非辐射衰变之间的平衡不令人满意，实现同时诊断和治疗仍然具有挑战性。B步骤1.肉芽肿靶向血管EPR 效应M. t B/耐药M. t B细菌死亡BBTD@PM NPs 1064 nm共挤出分枝杆菌特异性受体预活化巨噬细胞PM BBTD@PM NPs PLGA核心a PLGA受体-配体特异性结合TPE-BT-BBTD步骤2. M. t B靶向肉芽肿基于分枝杆菌预活化的巨噬细胞膜包被的光热NPs的TB的精确治疗诊断策略。A，制备BBTD@PM NPs的示意图。B，用于TB的光疗诊断的BBTD@PM NP介导的病变-病原体双重靶向的示意图。EPR，增强的渗透性和保留。
方法的应用
光治疗诊断避免了与耐药性相关的问题，在NIR-II窗口中具有显著优势，BNPs具有与受体配体特异性结合的同源靶向作用和延长药物循环时间等优点，本文介绍了用M. marinum包埋近红外-Ⅱ型AIEgen制备BNPs的方法，并对BNPs的生物活性进行了研究。制备的NIR-II AIE BNP显示出对结核分枝杆菌的特异性靶向和优异的光热杀菌结果，使其成为TB的体内治疗诊断学的有价值的工具。病变-病原体双重靶向能力和深穿透深度（~1 cm）可清晰显示单个小肉芽肿（直径0.2毫米），这是其他成像技术（如计算机断层扫描）不易达到的水平（1.0 mm分辨率）。鉴于特定病原体对巨噬细胞的刺激可导致靶向病原体的相关受体的上调，预计该货物系统可以潜在地扩展用于其他病原体相关疾病的精确诊断和治疗53，54。例如，用牛痘病毒预活化的巨噬细胞导致感染的脓疱内包裹的NIR-IIAIEBNP的靶向结合，它为猴痘提供了一种有效的治疗方案如病毒根除和阻断其传播。该方案描述了制备NIR-II AIE BNP的简化和标准化程序及其在结核病治疗中的应用，旨在为病原性感染性疾病的靶向治疗带来更多创新。
局限性和展望
细胞膜和多功能NIR-II AIEgens的整合赋予了NIR-II AIE BNP卓越的功能，如聚集增强的治疗诊断学，特异性靶向，长循环和良好的生物相容性，满足个性化和精准医疗日益增长的需求。虽然BBTD@PM NP用于靶向治疗感染的可及性已经得到验证，但大量的人类参与可能会产生批次变化，一种潜在的解决方案是采用自动化或半自动化合成技术，例如微流体芯片，以提高转化研究的再现性和可扩展性。此外，为了简化制备步骤，设计可以自组装成水分散性NPs的两亲性NIR-II AIEgens是一种可行的方法。在这方面，人工智能辅助的分子设计对于提高效率和降低时间成本是必要的。除了药剂之外，光源和光传输方法的进步也至关重要。考虑到人类和小鼠胸腔的明显解剖学差异，将该方案成功转化为人类环境仍然存在挑战。首先，具有与人类肺部区域相匹配的宽照射场的光源是必不可少的。其次，为了解决光穿透深度有限的问题，创新的光传输方法，如使用间质光纤，提供了有前途的解决方案。鉴于其实际和临床应用，光治疗诊断方法，仅仅依靠单一模态成像和单一疗法往往不足以达到令人满意的结果，由于每种模态的固有局限性，特别是在深层次疾病的情况下。在这方面，相关的多模式治疗诊断学结合传统的诊断技术，如计算机断层扫描和磁共振成像，沿着治疗方式，如化疗和免疫治疗，可以加速临床诊断的过程。
方法详述
在本方案中，我们提出了一个详细的方案，用于制备预刺激的巨噬细胞膜包裹的仿生BBTD@PM纳米粒，用于肺结核的靶向治疗诊断。
1. TPE-BT-BBTD的设计、合成与表征该方案的先决条件是多功能NIR-II AIEgen的设计，其被专门操纵以满足以下要求：（i）在NIR-II区域中可激发，这允许深度穿透，（ii）具有AIE特性的扭曲分子构象，以提供作为聚集体的高发射亮度，以及（iii）平衡的辐射衰变和非辐射衰变，以确保基于单一组分的同时诊断和治疗能力。
2.制备预刺激的巨噬细胞膜包被的BBTD@PM NP。首先，通过纳米沉淀将TPE-BT-BBTD掺入PLGA中以形成PLGA核。通过低渗裂解、均质破碎和差速离心等方法分离预活化的巨噬细胞膜，并将其包被在PLGA核上，制备成BBTD@PM纳米粒。
3. BBTD@PM NP的体外靶向和光疗功效验证。由于相关TLR的表达，与相同情况下的其它对照组相比，BBTD@PM NP显示出对分枝杆菌物种（例如海分枝杆菌和H37 Ra杆菌）的优异结合能力。BBTD@PM NP对结核分枝杆菌表现出优异的光热根除性能。
4.体内靶向FLI和光疗，按照标准操作建立肺结核小鼠模型，静脉注射BBTD@PM NPs后，在设计的时间点进行体内NIR-IIb FLI，在FLI的辅助下，进行PTT消除结核分枝杆菌。
BBTD@PM NP的表征
为了研究TPE-BT-BBTD的AIE特性，推荐四氢呋喃和超纯水的二元混合物，随着水含量（fW）的增加，TPE-BT-BBTD的荧光在初始阶段由于扭曲的分子内电荷转移效应而逐渐减弱，当形成高fW聚集体时，在增强荧光下，观察到明显的AIE现象。为了确认BNP的成功制备，从TEM结果中可以清楚地识别出BBTD@PM NPs的球形核-壳结构进一步的WB测定可以验证不同组中TLR的表达，BBTD@PM NP在NIR-IIb区域显示出强的NIR-II光捕获能力和强的荧光，在几次加热/冷却循环后，光热稳定性预期是优异的。
BBTD@PM纳米粒体外靶向结核分枝杆菌的能力和抗菌活性
为了探索体外靶向能力，分别用DiO（绿色）和mCherry（红色）标记BBTD@PM NPs和H37 Ra杆菌。DiO标记的（红色）BBTD@PM NP应显示与分枝杆菌物种如海洋分枝杆菌和H37 Ra的特异性结合效率为了验证BBTD@PM NP的光热灭菌活性，将H37 Ra与BNP共孵育，然后用1064 nm激光照射或不照射。在暴露于1064 nm激光下的组中可以观察到明显的C.F.U.减少，在板上几乎没有任何菌落形成。
肉芽肿的体内NIR-IIb FLI和肺结核的PTT
通过静脉注射BBTD@PM NP，可以在活的TB小鼠中清楚地鉴定感染的肺（2.0 mg kg-1），然后在NIR-IIb区域进行体内FLI。在用BBTD@PM NP治疗后应立即观察到TB小鼠胸腔中的明显荧光，即使在72小时后，强度也逐渐增加，并且具有高发射。应该注意的是，BBTD@PM NP特异性地积聚在感染肺的肉芽肿中，通过胸外和离体肺的NIR-IIb FLI可清楚显示。为了验证光热杀菌性能，在1在注射后24 h，从胸腔外照射064 nm 30 min，其穿透深度深，光热产生能力强，有望根除肺组织中的H37 Ra，这与没有1预期BBTD@PM NP的体外和体内生物毒性评价显示出良好的生物相容性。
参考文献
NIR-II aggregation-induced emission nanoparticles camouflaged with preactivated macrophage membranes for phototheranostics of pulmonary tuberculosis,Dingyuan Yan , Xue Li , Huanhuan Wang, Bin Li , Wei Wang , Yuhui Liao , Ben Zhong Tang & Dong Wang ,nature protocols,https://www.nature.com/articles/s41596-025-01146-8
