内容提要
高度结晶的半导体有机纳米探针由小分子染料和牛血清白蛋白组成的4 T-BSA在第二近红外窗口活体脑血管成像中显示出巨大的潜力（NIR-II，1000-1700 nm）。4 T-BSA纳米探针在完整小鼠脑中具有上级成像穿透深度，具有6.0的高信号背景比（SBR），并且在三种典型的神经病理生理学模型中脑血管的空间分辨率低至亚50 μm。通过可视化血管侧支灌注和白蛋白渗漏，4 T-BSA纳米探针识别了与脉/静脉侧支循环网络和BBB破坏相关的脑病理活动。
4T-BSA 纳米探针的合成与光学表征
所有 CH1055 的四个羧酸基团都被带有更多负电荷的磺酸基团取代（命名为 4T），随后与牛血清白蛋白（BSA）组装，从而获得 4T-BSA 纳米探针。4T 和 4T-BSA 纳米探针的紫外 - 可见（UV-vis）光谱在 320-1000nm 范围内明显呈现出相似的吸光度信号，而 4T-BSA 纳米探针在约 280nm 处有一个强吸光度峰，这归因于 BSA 分子的特征紫外吸收峰。4T 的发射光谱几乎是一条与横坐标平行的直线。4T 和 BSA 的自组装导致在近红外二区（NIR-II）成像系统下荧光强度显著增加。4T-BSA 纳米探针在约 990nm 处有一个最大荧光发射峰，在 808nm 激发下，其发射强度达到 4T 的 110 倍以上。
BSA 激活荧光发射这一有趣的特性促使我们研究 4T-BSA 纳米探针的微观结构。透射电子显微镜（TEM）图像和相应的粒径分布直方图明显表明，4T-BSA 纳米探针的胶体稳定性良好，呈球形，平均直径为 5.5±0.6nm，而 4T 或 BSA 则缺乏明确的纳米结构和形态，本质上是多分散的。通过高分辨率透射电子显微镜（HR-TEM）仔细测量，可以直接观察到 4T-BSA 纳米探针中发育良好的晶格条纹，其晶面间距约为 0.25nm。元素分布映射表明存在富含硫的厚内层黄色区域，这在一定程度上表明小分子 4T 自组装进入了 BSA 内部。原子力显微镜（AFM）证实 4T-BSA 纳米探针在水中表现出优异的单分散性，主要粒径范围在 3-7nm，与 TEM 分析结果一致。
在进行生物成像之前，具有良好生物相容性的 4T-BSA 纳米探针的血液循环时间是一个重要问题，因为较长的血液循环时间可能为持续监测血管功能障碍和恢复过程提供较长的成像窗口。对后肢主要动脉（股动脉）的 NIR-IIa 强度分析表明，注射 4T-BSA 纳米探针 120 小时后，其在血管中的可视化时间较长。通过二室药代动力学模型计算，相应的血液循环半衰期约为 181 分钟。此外，药代动力学分析暗示 4T-BSA 纳米探针可以通过胆汁系统排泄，并在注射后约 5 天以有机染料和血清蛋白的方式从小鼠体内完全排出。在平行实验中，通过选择 1150-1400nm 的连续长通滤光片，发现波长窗口长达 1350nm 时，脑血 管成像比短波长窗口更清晰，之后深部血管的信号会减弱。对脑血管横截面强度分布的进一步定量信噪比（SBR）测量显示，在 808nm 激发下，NIR-II 成像的最大分辨率出现在 1350nm 长通滤光片（NIR-IIa 窗口）下。在以下章节中，除非另有说明，深部脑成像均在 NIR-IIa 窗口进行。
脑血管的高分辨率近红外二区 a（NIR-IIa）成像
为了探究近红外二区（NIR-II）成像观察脑循环系统病理生理过程的可行性，将 4T-BSA 和吲哚菁绿 - 牛血清白蛋白（ICG-BSA）纳米探针以等效剂量（35nM）分别静脉注射到三种典型的神经病理生理小鼠模型中（每组 n = 3）。值得注意的是，ICG-BSA 是一种近红外一区（NIR-I）纳米探针，其最大发射波长约为 810nm。在 808nm 激光照射下，通过完整的头皮和颅骨，在 1350-1650nm 的窄成像区域内，对小鼠大脑的脑血管系统进行大视野成像记录。与 ICG-BSA 纳米探针在近红外一区（<900nm）无法区分血管且计算得到的信噪比更低形成鲜明对比的是，4T-BSA 纳米探针在近红外二区 a 窗口进行的脑血管荧光成像，无论神经病理生理小鼠模型如何，都能明显展现出更高的空间分辨率。在假手术近红外二区 a 组中，4T-BSA 纳米探针拍摄的脑血管造影图像清晰地显示了大脑中动脉（MCA）、大脑下静脉、上矢状窦（SSS）、横窦、窦汇，以及头皮和颅骨下双侧大脑半球的大量皮质血管和脑微血管。4T-BSA 纳米探针在近红外二区 a 区域对上矢状窦的信噪比计算为 6.0±0.1，远高于 ICG-BSA 在近红外一区窗口的信噪比（1.7±0.2；P<0.01）。在近红外二区 a 区域成像的上矢状窦的高斯拟合半高宽（FWHM）估计为 702±3.9μm，而 ICG-BSA 纳米探针成像的上矢状窦半高宽显著增加到 1105±8.2μm。此外，左侧和右侧大脑中动脉区域选定血管的半高宽分别为 206±2.3μm 和 149±4.1μm。4T-BSA 纳米探针出色的近红外二区 a 成像特性，为解决如何准确、无创且实时记录脑血流微小路径的成像难题奠定了基础。
上述脑血管高分辨率近红外二区 a 成像的展示，为更好地理解血管功能障碍和恢复过程提供了新的契机。在大脑中动脉闭塞（MCAO）近红外二区 a 组中，在对侧半球的右侧大脑中动脉区域可以明显观察到 4T-BSA 纳米探针的近红外二区荧光信号，而在左侧（同侧）半球（白色虚线圆圈标记处）则几乎没有信号。右侧大脑中动脉区域选定血管横截面强度分布的半高宽测定为 197±7.1μm，而左侧镜像动脉则无法测量，这表明大脑中动脉区域存在低灌注情况。同样，在脑静脉窦血栓形成（CVST）近红外二区 a 组中，4T-BSA 纳米探针可以照亮双侧大脑中动脉区域左侧大脑中动脉区域选定血管的半高宽为 129±5.2μm，信噪比高达 5.2±0.1，而在上矢状窦区域几乎监测不到荧光信号。因此，近红外二区 a 成像能够精确定位 CVST 模型中的血栓位置。
脑血流动力学灌注的定量分析
为研究局部脑血流（衡量局部神经元活动的有效指标），将 4T-BSA 纳米探针（35nM）分别通过尾静脉注射到假手术组、大脑中动脉闭塞（MCAO）组和脑静脉窦血栓形成（CVST）组的 C57BL/6 小鼠体内 。记录时间序列的近红外二区 a（NIR-IIa）图像（采用 1350nm 长通滤光片、808nm 激发光，成像速率为每秒 1 帧），以研究不开颅情况下大脑视野内的信号波动。在假手术 NIR-IIa 组中，近红外二区荧光强度随着注射时间的延长而迅速增加。正如预期的那样，左侧大脑中动脉区域的 NIR-IIa 信号强度几乎与右侧相等，这表明双侧大脑中动脉区域的灌注速率相同。
在 MCAO 组中，注射 4T-BSA 纳米探针后 1 秒内，右侧大脑中动脉（对侧）区域就立即出现荧光信号。值得注意的是，右侧大脑中动脉的荧光信号迅速增强，并在注射后约 40 秒达到稳定状态，而左侧大脑中动脉（同侧）区域（黄色虚线圆圈所示）几乎没有 NIR-IIa 信号。对动态荧光信号波动的分析表明，大脑左侧大脑中动脉区域的血流灌注明显减少。例如，右侧大脑中动脉区域的脑血流灌注速率比左侧缺血的大脑中动脉区域高出约五倍。
此外，在假手术组中，上矢状窦前后区域的 NIR-IIa 信号没有明显差异。令人印象深刻的是，在 CVST 组中，注射 4T-BSA 纳米探针后，上矢状窦前部区域立即出现 NIR-IIa 荧光信号。与此同时，上矢状窦后部区域（绿色虚线圆圈所示）的 NIR-IIa 信号几乎可以忽略不计，该区域代表血栓形成的部位。上矢状窦前部区域的脑血流灌注速率大约是后部区域的四倍，这表明由于上矢状窦后部的窦血栓形成（阻塞）导致静脉回流障碍。
结论
4T-BSA 纳米探针通过完整的头皮和颅骨，在整个小鼠大脑的大视野图像中解析了血流动力学。4T-BSA 纳米探针的近红外二区 a 成像清晰地展示了不同神经病理生理模型的成功构建。大脑中动脉闭塞模型可评估 4T-BSA 纳米探针穿透动态受损血脑屏障并靶向缺血驱动生物标志物的能力。脑静脉窦血栓形成模型用于强调 4T-BSA 纳米探针在低流量静脉系统中对血栓成像的特异性，突出其区分动脉和静脉血栓的潜力。癫痫模型旨在验证 4T-BSA 纳米探针对检测早期微血管异常的敏感性。4T-BSA 纳米探针可通过分析动态荧光信号波动来定量研究脑血流动力学灌注率。此外，近红外二区 a 动态成像准确地阐明了血流灌注不足的细节，并确定了大脑中动脉闭塞或脑静脉窦血栓形成模型中与缺血区域相对应的动脉或静脉侧支的开放情况。4T-BSA 纳米探针同时绘制灌注不足（侧支功能衰竭）和暗示血脑屏障渗漏（通过信号保留）的能力，可能为分层评估中风严重程度提供双重读数。上矢状窦前部的 4T-BSA 信号突出了具有残余侧支引流的区域，这些区域可作为溶栓治疗的靶点，以恢复静脉流出并减轻血脑屏障的压力。这些新的侧支或侧支吻合网络可能使脑组织在闭塞血管区域存活。
参考文献
Dynamic Pathophysiological Insight into the Brain by NIR-II Imaging,Si Chen, Hao Chen, Xinxin Li, Shuqing He, Kangquan Shou, Kun Qian, Zhao Fang, Feng Gu, Baisong Chang,* and Zhen Cheng*,Adv. Sci. 2025, 2416390,https://doi.org/10.1002/advs.202416390
