内容提要
本研究合成两种具有不同构型的异构体CZTBT和LVTBT。LVTBT，LVTBT@R848纳米粒子（NPs）具有较平坦的分子构型，具有较宽的吸收波长和较高的摩尔消光系数，其激发态对非辐射跃迁具有较强的旋转作用，导致高达36.3%的光热转换效率（PCE）。通过诱导树突状细胞（DCs）成熟、T细胞浸润、自然杀伤（NK）细胞和记忆性T细胞分化，激活强烈的免疫应答，从而显著抑制原发肿瘤和远处肿瘤的生长，同时限制肺转移。
设计、合成和基本性质
通过咔唑衍生物和4，8-二溴-6-（三氟甲基）苯基）-2-（三氟甲基）苯基甲酰胺之间的直接Suzuki偶联反应合成CZTBT和LVTBT。（2-乙基己基）-[1，2，5]噻二唑并[3，4-f]苯并三唑（TBT）。咔唑衍生物充当电子供体（D），而TBT充当电子受体（A），CZTBT和LVTBT是通过咔唑或苯环与中心核结构的连接性区分的异构体。CZTBT和LVTBT的最大吸收峰分别位于711和746 nm处，在808 nm处的摩尔消光系数为960和20000 Lmol -1 cm-1。值得注意的是，它们的光致发光（PL）波长范围为700 - 900 nm，能够实现近红外荧光成像（NIR FLI）引导的治疗。
光热性能
为了在肿瘤部位精准释放 R848，选用能对谷胱甘肽（GSH）产生响应的 DSPE-SS-PEG2000 作为纳米载体。采用纳米沉淀法合成了水分散性的 CZTBT、LVTBT 和 LVTBT@R848 纳米颗粒（NPs） 。紫外/可见光谱显示，在 676nm、724nm 和 725nm 处存在宽吸收峰，在 808nm 处的吸光度高于溶液中的其他波长。此外，PL 分析表明，溶液中的发射波长具有可比性，分别出现在 789nm、811nm 和 816nm。透射电子显微镜（TEM）证实所有纳米颗粒均呈球形。例如，LVTBT@R848 纳米颗粒的直径约为 100nm，这与动态光散射（DLS）测量结果一致。LVTBT 纳米颗粒和 LVTBT@R848 纳米颗粒的平均流体动力学直径分别约为 140.97nm 和 149.22nm。同时，由于通过 DLS 测量其粒径分布和多分散指数（PDI）变化极小，LVTBT@R848 纳米颗粒在 14 天内也表现出优异的稳定性。随后，对响应 GSH 且能够释放 R848 的 LVTBT@R848 纳米颗粒进行了研究。在 GSH 浓度为 10mM 时，观察到随着孵育时间的增加，三天内 R848 的释放量接近 89%。由于这些纳米颗粒在 808nm 处具有显著的光吸收，因此系统地评估了它们在 808nm 激光照射下的光热转换能力。与水或 CZTBT 纳米颗粒相比，LVTBT 纳米颗粒和 LVTBT@R848 纳米颗粒表现出更优异的光热性能。当暴露在功率密度为0.6 W cm-2的 808nm 激光下 60 秒时，水和相应纳米颗粒的温度分别记录为 27.0°C、37.7°C、65.1°C 和 67.5°C。随后，研究了不同浓度的 LVTBT@R848 纳米颗粒在 808nm 激光照射下的温度变化。产热呈现浓度依赖性增加。还分析了不同激光功率密度对 LVTBT@R848 纳米颗粒加热效率的影响，结果表明激光功率密度的增加与温度上升之间存在明显的相关性。
构型介导的高效非辐射跃迁
光热主要来源于OPTA的非辐射跃迁，因此，为了更深入地了解CZTBT和LVTBT的构型介导的非辐射跃迁差异，我们模拟了它们在单重激发（S1）态下的最佳结构。与S0结构相比，CZTBT的二面角1和2分别改变了0.99 °和1.26 °，这表明LVTBT在光激发下从S0态到S1态的转变涉及更大的分子旋转角，因此在返回S0态时，LVTBT将经历更强烈的分子运动，从而提高光热转换性能。作为进一步的证据表明CZTBT的S0和S1态的分子构象表现出高度重叠，表明分子旋转最小。相反，LVTBT中的咔唑基团发生了显著的旋转，总重组能（λ）CZTBT的λ值为5.29kcalmol-1，比LVTBT的λ值小（5.77 kcalmol-1），表明CZTBT的结构更加刚性。此外，确定了它们的S0状态和S1状态之间的均方根偏差（RMSD），CZTBT的RMSD为0.211，显著小于LVTBT的0.516，证明了CZTBT的分子刚性增加和分子变形减少。此外，研究了分子内运动各模式对无辐射衰减的贡献，低频区的分子扭转运动分别占34.0%和36.0%这突出了LVTBT经历的大量分子旋转，这有利于光热转换。
体外抗肿瘤性能
流式细胞仪检测结果显示，LVTBT@R848纳米颗粒在EMT6细胞内的相对红色荧光强度显著增加，从0h的4.85%上升到12h的96.3%，到24h变化最小（百分之九十九点九）。因此，确定12小时为最佳内化时间。接下来，使用市售的4，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）和Lyso-Tracker Green研究LVTBT@R848 NP的亚细胞器靶向特性。LVTBT@R848 NP的红色荧光信号与Lyso-Tracker Green的绿色荧光信号显著重叠，表明LVTBT@R848 NP主要定位于溶酶体中，Pearson's R值可达0.88。R848、LVTBT NP、和LVTBT@R848 NP的细胞存活率。经LVTBT@R848 NP处理的Beas2b细胞在黑暗条件下仍保持较高的存活率，表明其具有良好的生物相容性。类似地，LVTBT NP和LVTBT@R848 NP均对EMT6细胞表现出最小的暗毒性，在50 μ g mL -1的孵育浓度下，平均存活率超过94%。虽然低浓度的R848显示出良好的生物相容性，但较高浓度会导致显著的细胞毒性。在激光照射下，LVTBT@R848纳米颗粒对EMT6细胞的毒性呈浓度依赖性。在50 μ g mL -1的浓度下，细胞活力降至5%以下，表明激光照射后具有显著的光疗效果。结果表明，LVTBT@R848NP+激光组线粒体膜电位最低，线粒体损伤最严重，而JC-1荧光染料组线粒体膜电位最低，线粒体损伤最严重。calcein-AM和PI染色显示LVTBT@R848 NP + L组的肿瘤细胞杀伤能力最强。此外，使用流式细胞术对凋亡细胞进行定量分析支持了这些发现，显示在LVTBT@R848NP + L组中晚期凋亡细胞的比例增加，占83.5%，其显著高于其它组。这些结果表明LVTBT@R848NP可被EMT6细胞有效地摄取，从而在照射后诱导肿瘤细胞凋亡。在PTT过程中，产生的热量有可能损伤线粒体，导致细胞色素C（Cyt-c）释放增加，并促进胱天蛋白酶-3（C-caspase-3）裂解成其活性形式，最终诱导PTT介导的肿瘤细胞凋亡。为了更深入地了解LVTBT@R848 NP引起细胞损伤的机制，进行了蛋白质印迹（WB）实验。WB结果证实，在LVTBT@R848 NP介导的PTT后，Cyt-c和C-caspase-3的表达水平均显著上调。此外，PTT通过刺激DAMPs的释放而触发肿瘤细胞的ICD，DAMPs的关键标志物包括高迁移率族蛋白1（HMGB1）、钙网蛋白（CRT）和三磷酸腺苷（ATP），它们在增强TAAs的识别和呈递中起关键作用，WB和免疫荧光染色证实LVTBT@R848 NP + L导致最显著的CRT暴露和HMGB-1释放。此外，还采用酶联免疫吸附测定（ELISA）来评估HMGB1和ATP的表达。LVTBT@R848NPs + L处理的EMT6细胞培养上清中HMGB1和ATP含量明显高于其他各组，为证实释放的DAMPs是否能增强树突状细胞（dendriticcells，DC）的抗原提呈能力，我们通过体外共培养的方法对DC2.4细胞的成熟进行了初步的评估，将未成熟的DC2.4细胞与用一系列制剂处理过的EMT6细胞共培养，通过流式细胞术分析CD80和CD86共刺激分子的比例来评价成熟度。LVTBT@R848NP与激光处理的组合导致成熟DC的比例显著更高与其他组比较，ferrnecrosis factor-α（TNF-α）、IL-6等免疫刺激性细胞因子的水平用ELISA法测定。TNF-α和IL-6水平的升高表明光热免疫治疗引发的免疫应答显著激活。
多模态成像和体内代谢
LVTBT@R848纳米颗粒具有较强的近红外发射特性和良好的生物相容性，可用于体内荧光成像。将EMT 6细胞植入BALB/c小鼠皮下建立荷瘤模型，静脉注射LVTBT@R848纳米颗粒后1h内在肿瘤部位检测到较强的荧光信号，随着时间的推移，LVTBT@R848NP在肿瘤部位的累积增加，在注射后12小时达到峰值。随后，NP逐渐代谢，伴随荧光信号减弱。这些发现被PA成像和相应的定量分析所证实。LVTBT@R848纳米颗粒在肿瘤内的优先滞留增强了其体内光热成像（PTI）的潜力。如IR热成像所示，肿瘤部位的温度从35.0°C升高到55.8°C.（ΔT= 20.8°C），在用808 nm激光照射LVTBT@R848 NP处理的肿瘤后（0.6Wcm2，5 min）。值得注意的是，高热在相同条件下注射生理盐水时，肿瘤区域的温度没有明显升高。LVTBT@R848纳米颗粒的快速和有效的体内光热转化能力强调了其有效光热免疫治疗的潜力。随后，还评估了LVTBT@R848 NP在小鼠体内的代谢。24小时后，LVTBT@R848 NP广泛分布于血液、肝脏、肺、胃和肠中。到第5天，LVTBT@R848 NP在血液中的荧光强度明显降低，主要定位于肠道。10天后，在胃中仅检测到弱荧光，而在其他主要器官和肿瘤中几乎检测不到NPs的荧光，这表明大多数LVTBT@R848NPs在10天后排出体外。
体内抗肿瘤性能
在15天的随访期内，严格评估了LVTBT@R848 NP介导的光热免疫疗法的抗肿瘤效力。将原发性肿瘤大小为90 mm 3的EMT 6荷瘤小鼠随机分配到五个治疗组：（I）PBS;（II）R848;（III）LVTBT NP;（IV）LVTBT@R848 NP;（IV）LVTBT@R848 NP。和（V）LVTBT@R848 NPs + L。在施用LVTBT@R848 NPs后，在注射12小时后，将“L”组中的原发性肿瘤暴露于808 nm激光（0.6 Wcm-2）5分钟。每三天记录两侧的肿瘤体积以评估治疗反应。在治疗期间，在PBS、R848和LVTBT NP组中观察到不受控制的原发性肿瘤生长，表明单独的R848或LVTBT NP不足以抑制肿瘤进展。在LVTBT@R848 NPs+ L组中，侵袭性肿瘤生长被有效抑制，伴随着肿瘤消融和结痂形成，抑制率达97.74% PBS和R848 NP组中的远端肿瘤分别达到约557 mm3和534 mm3。值得注意的是，LVTBT@R848 NP与激光照射的组合显著抑制远端肿瘤生长，抑制率为81.2%提取的肿瘤的照片进一步证实了当暴露于808 nm激光时LVTBT@R848 NP的上级抗肿瘤作用。LVTBT@R848 NP +L组中原发肿瘤和远处肿瘤的平均重量仅为PBS对照组的3.6%和21.5%，减轻的脾肿大进一步支持LVTBT@R848 NP加激光的上级抗肿瘤作用。
总结
命名为CZTBT和LVTBT的两种异构体仅在分子构型上不同，但表现出深刻不同的光热转换能力。具体地，LVTBT与CZTBT相比，在808 nm处表现出扩展的吸收范围和上级捕光能力。这可以归因于其更平坦的结构。理论计算和fs-TA光谱显示LVTBT经历了更明显的二面角旋转和更快的衰减曲线，表明LVTBT的构型对激发态动力学有更显著的影响，有利于更有效的非辐射跃迁。LVTBT@R848纳米粒介导的光热免疫治疗作为原位肿瘤疫苗，在激光照射下有效地清除肿瘤细胞并诱导ICD，同时促进DMAPs的释放、抗原提呈、DC成熟和T细胞浸润，体内实验表明，对原发肿瘤和远处肿瘤的生长抑制率为97.74%，总的来说，这项研究强调了一种有前途的策略，即构型介导的非Angewandte Chemie Research ArticlerRadiative transition，它具有先进光热免疫治疗的潜力，并拓宽了OPTAs设计和合成的范围。
参考文献
Configuration-Mediated Efficient Non-Radiative Transition for R848- Assisted Photothermal Immunotherapy to Inhibit Tumor Growth and Metastasis by An In Situ Tumor Vaccine Strategy,Jianan Dai, Laiping Fang, Xuan Wang, Jie Hua, Yike Tu, Shufang Li, Kuo He, Lifeng Hang, Yuan Xu, Jin Fang, Lina Wang, Jin Wang,* Ping’an Ma,* and Guihua Jiang*,Angew. Chem. Int. Ed. 2025, 64, e202417871,https//doi.org/10.1002/anie.202417871
