内容提要
近红外II荧光探针具有上级穿透能力强、自发荧光可忽略、荧光发射波长长等优点，可显著提高体外检测的信噪比（SNR）和体内成像的时间分辨率。本文介绍了本课题组近年来在近红外-Ⅱ荧光探针分析应用领域的代表性工作，从生物标志物的体外检测到不同生物标志物和各种疾病的体内成像监测，这也将进一步提供近红外-Ⅱ荧光探针分析应用的总体概述。首先，综述了近红外荧光探针在体外分析中的应用，包括肿瘤标志物检测、病毒和细菌分析、细胞检测和小分子传感等，并对近红外荧光探针在体内成像监测中的应用进行了详细的讨论，包括ROS检测、气体监测、pH传感、小分子检测、受体分析以及一些严重疾病的影像诊断。
近红外荧光探针在体外检测中的应用
基于NIR-II荧光探针的荧光检测除了具有响应速度快、无创、多参数检测能力等固有特点外，还能有效避免自体荧光干扰，大大提高检测方法的信噪比，在体外诊断领域显示出巨大的潜力，特别是本课题组和其他课题组的NIR-II荧光探针的体外分析应用，如肿瘤标志物检测、病毒和细菌分析、细胞检测和小分子传感，已系统地总结在表1中。依靠NIR-II荧光探针对这些生物标志物的灵敏和精确检测，它们可以更有效地预测和更及时地监测不同疾病的发生和发展进程，在不久的将来将显示出更大的临床应用价值。
肿瘤标志物检测
肿瘤标志物（TM）的准确、便捷检测对于肿瘤预防、早期诊断、治疗计划和疗效评估至关重要。荧光侧流检测（LFA）是一种快速发展和广泛使用的床旁检测（POCT）技术，具有操作简单、快速、成本低、灵敏度高、可进行多项目联合检测等优点。我们的研究小组开发了一种新的侧流测定法（LFA），其利用在NIR-II波长范围内发射的RENP，用于检测癌胚抗原（CEA），一种具有广泛适用性的肿瘤标志物。制备的RENP在约1064 nm（NIR-II）和1345 nm（NIR-IIa）处显示双峰荧光发射，由于在NIR-II范围内的双重荧光发射，以及强的荧光穿透、最小的自发荧光和RENP的上级光稳定性，所提出的NIR-II LFA在1至320 ng mL-1的浓度范围内表现出值得注意的线性响应。检测限达到了令人印象深刻的低0.37 ng mL-1，新开发的NIR-II LFA方法的性能与荧光免疫测定法（CLIA）的性能非常接近，产生高相关系数这些发现强调了NIRII-LFA方法在临床环境中定量测量CEA的可靠性和有效性）。随后，我们开发了一种先进的ENIR-II LFA平台，利用超分子主客体自组装检测前列腺特异性抗原（PSA）作为代表性分析物。通过采用有效的超分子表面修饰策略，我们制备了葫芦脲（CB[7]）包被的RENP，通过利用它们作为高效荧光探针，它们在NIR-II区域内发射（RENPs-CB[7]）。由于其出色的光学特性和增强的抗体偶联效率，ENIR-II LFA平台表现出0.65至120 ng mL−1的广泛线性检测范围，PSA的检测限低至0.22ng mL-1，与其他文献记载的比色和荧光技术相比，ENIR-II LFA在分析灵敏度、线性范围和检测时间方面显示出多重优势。
病毒和细菌分析
细菌和病毒检测的重要意义在于及时发现和诊断传染病病原体，为精准医疗、控制疾病传播、保障公众健康提供关键依据。该平台是利用一对下移位的镧系元素纳米粒子（DSNPs）构建的，具体地说，是以Nd 3+掺杂的DSNPs为能量供体，Yb 3+掺杂的DSNPs为能量受体，该平台在全血、全血促进临床全血样本中SARS-CoV-2中和抗体的高灵敏度无背景均相检测（LOD = 0.5 μgmL-1）和符合要求的专属性。详细地说，这些NIR-Ⅱ荧光探针的检测机制通常是通过抗原-抗体相互作用，其可以被描述为抗体标记的NIR-Ⅱ荧光探针与抗原形成复合物（病毒或细菌），然后在测试（T）线被包被抗体捕获，形成三明治免疫-定量浓度可以通过建立抗原浓度与在T细胞上观察到的荧光强度之间的关系来确定线。
小分子传感
由于一些小分子（SM）在维持体内生理功能中起重要作用，例如三磷酸腺苷（ATP）、多巴胺（DA）和三甲胺（TMA），因此还需要在真实的时间内灵敏地检测这些SM。Tian及其同事开发了一种荧光各向异性（FA）技术，使用NIR-该方法利用NIR-II荧光Ag 2Se量子点，（Em = 1050 nm）作为标记以最小化基质自发荧光的影响，并掺入氧化石墨烯（GO）以放大荧光各向异性信号。NIR-II Ag 2Se量子点标记的适配体（QD-pDNA）与ATP之间的相互作用促进了QD-pDNA从GO的释放，导致FA值的显著降低。ATP的定量检测可在3至2500 nM的浓度范围内实现，检测限为1.01 nM，这与荧光相当，作为人类肠道微生物群代谢的副产物，三甲胺（TMA）可以在肝脏中经历进一步氧化以形成氧化三甲胺（TMAO），这可能导致各种人类健康问题，例如心血管疾病、慢性肾病、糖尿病、糖尿病、Zhao等人开发了一种称为ZS-1010的新型小有机NIR-II荧光团分子，ZS 1010分子具有一个强大的推拉电子系统，由一个电子组成，ZS-1010是一个由三个电子给体单元和一个电子受体单元组成的结构，在近红外光谱中具有显著的吸收和发射特性。在与TMA相互作用时，ZS-1010的推拉框架的性质受到TMA强给电子性质的影响。这种偶极矩的改变导致荧光猝灭。ZS-1010和TMA之间的结合动力学非常有效，NIR-II荧光的减少产生了用于TMA检测的可靠信号，证明了与0至100 μM范围内的TMA浓度的强线性相关性。因此，ZS-1010显示出作为NIR-II荧光探针用于在生理条件下检测TMA的相当大的前景。
近红外荧光探针的活体成像监测
基于高效NIR-II荧光探针的荧光成像技术，可以深入组织，减少自发荧光干扰，提高成像深度和分辨率，支持实时监测生物标志物的动态变化以及各种疾病的发生和进展，为个性化医疗提供强有力的工具。NIR-II荧光探针的体内成像监测应用，如活性氧（ROS）检测、气体监测、 pH传感、受体分析和小分子检测以及一些严重疾病的成像监测。
各种生物标志物的体内成像监测
ROS检测
活性氧（ROS）是细胞代谢过程中产生的氧自由基和非自由基的衍生物，主要包括羟基自由基（·OH）、2过氧亚硝酸根（ONOO−）、34，35过氧化物（H2 O2）、36 −38次氯酸根（ClO−）、39，40和次氯酸（HClO），41它们与炎症、细胞损伤和生物体内各种疾病的发展有关。我们的团队开发了一种旨在增强抗肿瘤免疫的ROS纳米发生器，其特征在于pH可解离的Fe 3 +-没食子酸（Fe-GA）复合物作为其外层和镧系元素掺杂的发光纳米颗粒（LnNP，NaErF 4：2%Ce@NaYF 4@NaYbF 4：0.5%Tm@NaYF4），与光敏剂偶联在NIR光暴露下，LnNP表现出从紫外（UV）到可见光（维斯）的多波段上转换发射，以及在有希望的NIR-II成像范围内的下移发射。紫外光和还原剂GA可以促进Fe 3+的还原，从而增加Fe 2+参与芬顿反应的有效性，产生用于铁凋亡治疗（FT）的·OH。
气体监测
硫化氢（H2S）在许多生物过程中起着重要作用，如细胞生长、心血管保护、血管舒张、抗炎、抗氧化和抗血小板聚集。42，43 Wang及其同事开发了一种在H2S存在下活化的原位比率纳米探针，该纳米探针包括能够发射NIR-12的降转换纳米颗粒（DCNP），II当由980 nm激光（F1550 Em，980 Ex）激发时在1550 nm处的荧光。此外，将人血清白蛋白（HSA）连接到DCNP表面的Ag+上以产生DCNP@HSA-Ag+纳米探针。当存在H2S时，在HSA涂层内产生Ag 2S QD，在用808 nm激光激发时在约1050 nm处发射荧光（F1050Em，808 Ex），这是由于H2S和Ag+引发的化学反应。II比率纳米探针被有效地用于精确定量检测H2S，并通过开发一种用于精确定位结肠癌的方法，内源性H2S触发的原位还原反应导致Ag2S QD的形成。
pH传感
监测肿瘤病灶的pH值水平可获得丰富的生理信息。为了在更宽的范围内实现高灵敏度的肿瘤pH值监测，Zhang等人通过简单地调节Fo Prster共振能量转移（FRET）中NIR-II发射氮杂-BODIPY（NAB）供体和pH敏感的罗丹明基预受体（NRh）的组分比，开发了一系列pH可调传感器（pTAS）。通过组合pTAS的pH响应范围，获得宽两倍的pH检测范围（6.11−7.22）比标准pH传感器的pH值高（6.38−6.94）。由于pH值可调，肿瘤pH波动的动态过程可以通过NIR-II窗口中的双通道比率生物成像在体内可视化，与传统pH计相比，其变异系数低于1%。
受体分析
已经设计了许多光学探针来特异性靶向癌症生物标志物，以促进这些分子的空间分布的可视化。我们的团队开发了一种创新的NIR荧光探针，名为IRDye 800 CW-E2，旨在对患有乳腺肿瘤的小鼠的ERα进行靶向成像。该探针由花青染料IRDye 800 CW组成，用作NIR荧光团，与E2类似物炔雌醇胺结合，炔雌醇胺作为靶向ERα的配体。首先，炔雌醇胺与FITC结合，以评估其体外与人乳腺肿瘤细胞结合的特异性。来自流动室测试和体外共聚焦激光显微内镜的实验数据表明，MCF-7细胞有效地内化了FITC-E2化合物。近红外荧光成像表明，IRDye 800 CW-E2可以快速靶向肿瘤，在注射后4至48小时内实现肿瘤与背景信号的高对比度。此外，通过同时给予内源性ERα-配体，17β-雌二醇（E2），进一步的离体荧光成像验证了探针在肿瘤中的显著摄取。这些发现表明IRDye 800 CW-E2作为靶向ERα的成像探针，在乳腺肿瘤的早期检测中具有重要的前景，并具有临床应用的潜在意义。
小分子检测
有机小分子包括三磷酸腺苷（ATP）和谷胱甘肽（GSH），它们在体内参与重要的生命活动，如能量代谢、信号传递、大分子构建、细胞结构维持、代谢调节和抗氧化等。 Wang等人设计了一种新型植物纳米双离子传感器，用于植物细胞外三磷酸腺苷（eATP）的体内检测。他们开发了一种NIR-II荧光金属有机框架（MOF）纳米探针，增强了对植物中信号分子的监测能力。该纳米探针，IR-1061胶束@ZIF-90具有三明治结构，ZIF-90涂层后，NIR-II荧光显着增加。它成功地应用于环境胁迫下植物中eATP的时空监测。Liu等开发了一种GSH激活探针（MCPSE），用于体内GSH的近红外荧光和比率光声成像，该探针基于J聚集体的自组装和分解，与GSH反应后，在940 nm处的发射峰强度显著增加，使荷瘤小鼠的GSH可视化，通过NIR-II FL和PA双模式成像区分正常和肿瘤区域。
各种疾病的体内成像监测
肿瘤的原位成像诊断
精确识别小肿瘤仍然是癌症诊断中的一个挑战，大多数体内成像技术还不够灵敏，无法检测超小的癌性病变。我们的小组已经提出了NIR-II磷光探针的体内利用，其特征在于寿命为数百微秒，斯托克斯位移测量为430 nm。在酸性条件下（pH 5.5 - 6.5），铜铟硒纳米管从荧光转变为磷光。在骨肉瘤和乳腺癌的异种移植模型中，通过静脉或瘤内注射给予探针促进磷光成像，与使用聚合物稳定的铜-铟-硫化物纳米棒的NIR-II荧光成像相比，实现了更高的S/N比，空间分辨率和灵敏度。磷光成像具有为各种生物医学应用提供增强成像能力的潜力。
神经功能的实时成像监测
神经解剖束示踪剂在探索神经系统内的轴浆运输和复杂连接方面发挥着至关重要的作用。血脑屏障（BBB）限制大多数物质进入中枢神经系统，这限制了具有大分子结构的NIR-II染料在脑成像中的使用。我们的团队已经创建了一系列二氟化硼（BF2）甲氮基NIR-II染料，所有合成的染料（BF1-BF8）在DMSO和FBS中的荧光光谱在800 ~ 1400 nm范围内显示出宽的发射带。通过对BF2甲偶氮染料的苯胺部分进行修饰，我们显著地提高了它们穿过血脑屏障进行非侵入性脑成像的能力。完整的小鼠脑成像和实时跟踪染料穿过血脑屏障的扩散利用了NIR-II光谱内的这些BF2甲偶氮染料。在胶质母细胞瘤的小鼠模型中，当存在胶质瘤时，BBB抑制ICG渗漏到脑组织中，然而，具有肿瘤的脑显示不一致的荧光成像，并且某些脑组织的荧光强度在注射BF1和BF6后从0到60 min升高，证明了它们区分肿瘤与正常脑组织的潜力。
总结
近红外荧光探针在生化分析领域的应用优势（体外检测和体内监测）可以概括为三个方面：1）提高灵敏度的NIR-II荧光可以大大降低背景噪声，导致高信噪比和高检测灵敏度，2）可靠性增强，NIR-II荧光探针的发光稳定，荧光强度高，灵敏度高，适合低浓度目标的监测（RENP和QDs）可以有效地保证分析过程的可靠性和重复性。3）通过结构修饰和转换，提高了NIR-II荧光探针的准确性，赋予了可调谐的荧光发射和荧光寿命，为各种"智能"探针的设计提供了可行的思路。比率荧光探针通过多通道信号采集和关联，具有自校正功能，实现定量分析和监测。由于受到规模制备、安全性、准确的疾病反馈、适当的PK/PD和专业管理等多重因素的限制，已报道的NIR-II荧光探针的临床转化仍不确定，因此，在设计新一代NIR-II荧光团时，首要考虑的标准应包括良好的生物安全性、良好的代谢能力和功能化，除了高量子产率、优异的光稳定性和易于制备之外。特别是，具有靶向功能的NIR-II荧光团的直接化学设计而不是依赖于合成后对表面的修饰被证明在提高治疗功效方面更有效。此外，促进具有仔细调节的降解速率的可生物降解的NIR-II荧光团的设计和合成也是可预见的。
参考文献
Near-Infrared-II Fluorescent Probes for Analytical Applications: From In Vitro Detection to In Vivo Imaging Monitoring,Sha Liu, Wenhong Dong,Hui-quan Gao,* Zhaorui Song,* and Zhen Cheng*,Acc. Chem. Res. 2025, 58, 543−554,https://doi.org/10.1021/acs.accounts.4c00671
