内容提要
本文提出一种用于GBM的NIR-II光声（PA）成像引导的光化学协同免疫治疗的分级靶向平台。通过增强的分子运动，促进光热转换和PA信号。该探针与温敏前体药物结合，组装成纳米颗粒，进一步包裹肿瘤细胞膜，并用转铁蛋白模拟肽进行生物正交修饰，促进血脑屏障穿透和GBM靶向。高对比度NIR-II PA成像可以精确检测和描绘GBM，为后续治疗提供准确指导。与高脂血症激活的前药结合，显著诱导免疫原性细胞死亡，增强肿瘤杀伤效率并放大抗肿瘤免疫应答。这种自身协同免疫疗法不仅激发强大的抗肿瘤免疫力并抑制原发性肿瘤生长，而且还预防术后肿瘤复发。
分子探针的合成与表征
为了获得有机NIR-II发色团，我们采用了推挽策略，一种用于调节电子带隙的高效方法。设计并合成了两种供体-受体-供体（D-A-D）型分子。辛氧基取代的三苯胺（OT）由于其强的给电子性质而被用作D单元。此外，OT的长烷基链和非平面结构可以为聚集态的分子运动提供空间。联噻吩既作为��-桥间隔基又作为D基团，苯并二噻二唑（BS）或苯并噻二唑硒二唑（BSe）作为高共轭吸电子结构的A部分，得到了两个具有微小单原子变化的低带隙分子。我们研究了这两种分子的水物理性质。TTBS和TTBSe表现出强的近红外吸收，最大值分别在770和1007 nm处。TTBSe的红移超过200 nm可以归因于其增强的共轭和吸电子能力。为了赋予疏水分子水溶性，将TTBS和TTBSe封装到NP中，分别得到S NP和Se NP。鉴于NP的强NIR吸收特性，我们检查并比较了光热效应。在NIR光照射下，NP溶液的温度随时间增加，在10分钟内达到平台。值得注意的是，S纳米颗粒和Se纳米颗粒的温度增加到155和66 °C，光热转换效率（PCE）为37.0%和55.1%。II光热及相关应用。辐射荧光和非辐射热失活是两个竞争过程，因此我们研究了不同状态下的荧光。与它们的溶液状态相比，TTBS和TTBSe的光致发光强度在NP形式中降低。这表明TTBSe的光激发态能量主要指向非辐射衰变途径，使其特别有利于PA和PTT应用。为了开发可光热活化的前药，将两个PTX分子与热敏偶氮双[N-（2-甲氧基苯基）-2-甲基-N-（2-甲氧基苯基）-2-（2-甲氧基苯基 PTX-偶氮的合成和表征在支持信息中给出。偶氮基团被设计成在热刺激下裂解，这通过热处理后PTXAzo的HRMS曲线证明，其在m/z 853.3309处显示峰，与PTX精确一致（853.3310），表明PTX-Azo的热诱导药物释放特征。
纳米制剂的制备与表证
利用Pluronic F127纳米沉淀法将TTBSe和PTX-Azo制备成水溶性纳米粒，并将其表面包裹在胶质瘤细胞膜上，以增强其对GBM的靶向性。近年来，肿瘤细胞膜包裹纳米粒代表了一类新兴的表面修饰策略，其模拟了肿瘤细胞的特性，包括同源靶向性，为了进一步克服胶质瘤治疗诊断中的BBB屏障，使用生物正交化学将转铁蛋白模拟肽T7缀合至细胞膜表面。共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）图像揭示了GL 261细胞表面上的强绿色荧光信号随后，将人工肽配体二苯并环辛炔修饰的T7（DBCO-PEG 2-T7），通过叠氮基团的点击化学将修饰的细胞膜偶联到细胞膜上，然后通过反复挤压将修饰的细胞膜涂覆到SeP纳米粒上通过一系列具有减小的孔径的水相过滤器，导致SeP@MT NP的形成。SeP NP和SeP@MT NP都显示出球形结构，平均流体动力学直径分别为1.91和106 nm。在SeP@MT NPs的表面上存在一层薄的脂质壳层，厚度约为1.8 nm，证实了膜涂层的成功形成。它们都表现出负的Zeta电位，为1.5 - 10 mV。Western印迹分析进一步证实了特异性表面蛋白，如CD 47和整合素V，在SeP@MT NPs上的保留，赋予它们逃避吞噬作用和促进体内同源靶向的能力。总的来说，这些发现证明了成功构建膜包衣纳米剂。此外，TTBSe和PTX-偶氮在SeP@MT NP中的包封效率分别测定为76.5%和83.3%。我们进一步评估了这些颗粒随时间的胶体稳定性。SeP NP和SeP@MT NP的流体动力学尺寸在3天内显示出可忽略的变化，表明它们在生理条件下作为稳定递送系统的潜力。我们研究了SeP@MT NPs的光热和PA性质。在1064 nm光照射下，SeP@MT NPs的温度与NP浓度和激光功率强度成比例地增加，当0.1 mM NPs暴露于1.0 W cm-2的1064 nm激光10 min时，温度达到70，此外，SeP@MT NP显示出显著的光热稳定性，在1064 nm激光开和关过程的五个循环中光热效应的变化可忽略不计。相反，临床上使用的吲哚菁绿色（ICG）经历严重的降解，这由光热温度的显著降低证明。SeP@MT NPs表现出高度稳定的吸收强度，而ICG表现出吸收强度的显著降低。考虑到SeP@MT NP的优异光热性质，我们进一步研究了它们的PA性质。在各种激发波长下测量SeP@MT NP的PA振幅，显示与NIR-I区域相比，NIR-II辐照下的PA信号稳健，与其吸收特性一致。SeP@MT NPs在960 nm处的PA强度与浓度表现出良好的线性关系，表明用于定量分析的巨大潜力。在PA激发光照射下保持几乎恒定的信号我们进一步研究了SeP@MT NP中PTX-偶氮的光热触发活化。PTX的释放随着NIR-II激光照射时间增加，当SeP@MT NP暴露于1064 nm光（0.8 W cm-2）10 min时，PTX转化率达到50%以上，而在没有NIR-II激光暴露的情况下观察到最小的游离PTX。
体外细胞研究
我们进行SeP@MT NP的抗肿瘤性能的体外细胞评估。最初使用CLSM评估各种纳米制剂的细胞摄取。将3′-双十八烷基氧碳菁高氯酸盐（DiO）作为荧光标记物掺入纳米粒子中，与小鼠胶质瘤细胞GL 261共培养4 h后，CLSM成像显示，与未修饰的SePNP相比，具有癌细胞膜伪装的SeP@M纳米粒子的内化能力明显增强值得注意的是，SeP@MT NPs在GL 261细胞中表现出最显著的摄取，T7肽配体，其对脑毛细血管内皮细胞和神经胶质瘤细胞上过表达的转铁蛋白受体（TfR）具有高亲和力，定量分析显示，SeP@MT NPs中的绿色NP荧光信号，经处理的细胞的靶向能力分别比用SeP NP和SeP@M NP处理的细胞强1.37倍和1.5倍，突出了双靶向策略所实现的有效的肿瘤细胞靶向能力。使用GL 261多细胞球体进一步评估SeP@MT NPs的肿瘤内化和渗透能力。
我们接下来使用体外BBB模型评估了SeP@MT NP穿越BBB的能力小鼠脑微血管内皮细胞（bEnd.3）接种在上室上，将各种NP加入上室并孵育24小时。随后，从下室收获神经胶质瘤细胞以使用流式细胞术分析NP的内化。在SeP NP处理组的下肿瘤细胞中检测到最小的NP信号，这表明未修饰的NP的有限的被动BBB穿过。SeP@M NP组显示出肿瘤细胞中NP摄取的显著增加，这表明在细胞膜包被后，纳米颗粒的血脑屏障通透性增强。癌细胞膜表面上的蛋白质如整联蛋白的存在可能促进了包封纳米颗粒穿过血脑屏障。SeP@MT NPs具有明显的上级血脑屏障穿透能力，在肿瘤细胞中观察到最强的NP荧光，定量分析显示SeP@MT NPs穿透血脑屏障细胞层进入基底侧肿瘤细胞的能力分别是SeP NPs和SeP@M NPs组的18.3倍和2.2倍，考虑到TfR在BBB上的表达升高，T7肽的修饰可以通过TfR介导的转胞吞作用增强BBB穿越。我们进一步进行阻断实验以验证BBB穿透的潜在机制。用游离的抗-TfR抗体阻断TfR导致位于transwell下室的GL 261细胞中NP荧光信号显著降低。这一发现表明，TfR和T7肽之间的特异性相互作用在增强SeP@MT NPs的血脑屏障渗透中起重要作用。
随后，我们进行了3-（4，5-二甲基噻唑-2-基）2，5-二苯基溴化四唑（MTT）分析以评估各种制剂的细胞毒性。将GL 261细胞暴露于不同浓度的PBS、P NP、Se NP、SeP NP或SeP@MT NP，然后不照射或暴露于1064 nm光。PBS组和非激光照射组均表现出最小的细胞毒性，GL 261细胞存活率超过90%，SeP@MT NPs对正常细胞如HUVEC和MCF 10A细胞的细胞毒性也很小这些发现表明这些纳米制剂的暗细胞毒性可忽略。然而，在NIR照射下，Se NP表现出对细胞活力的浓度依赖性抑制，值得注意的是，与Se NPs +光组相比，在SeP NPs组中观察到更高的光毒性。在SeP NPs的情况下，NIR-II PTT效应不仅直接根除肿瘤细胞，而且还触发游离PTX从热响应前药PTZ-偶氮唑释放，显著地，用“SeP@MT NPs + L”处理的细胞的存活率明显低于用“Se NPs + L”或“SeP NPs + L”处理的细胞的存活率，“这是由于肿瘤细胞膜-T7涂层促进了增强的肿瘤靶向亲和力。结果表明，在40 μg mL-1的激光照射下，“SeP@MT NPs + L”组的肿瘤细胞杀伤率达到75%以上，活-死细胞共染色法检测细胞存活率，用钙黄绿素-AM和碘化丙啶（PI）区分活细胞和死细胞。与其他实验组相比，“SeP@MT NPs + L”组在激光照射下表现出明显的细胞毒性，这可以通过死亡细胞发出的显著的红色荧光来证明。这些结果与MTT测定的结果一致，证实了SeP@MT NP在激光照射下的有效肿瘤细胞杀伤能力。流式细胞术通过AnnexinV-FITC/PI染色评估细胞凋亡率。在不存在光照射的情况下，超过95%的用PBS、P NP或SeP@MT NP处理的细胞保持存活凋亡和坏死细胞的比例（膜联蛋白V+ PI+细胞）在Se NPs + L和SeP NPs + L组中分别增加至12.1%和29.9%。经“SeP@MT NPs + L”处理的GL 261细胞表现出更显著的细胞凋亡和坏死增加，达到48.6%，这些结果表明，SeP诱导的细胞死亡与SeP诱导的细胞死亡相比，激光照射下的MT NPs主要通过坏死或晚期凋亡途径发生。
体内脑肿瘤靶向功效
为了促进体内NP追踪，使用NIR荧光染料，1，1-双十八烷基-3，3，3，3-四甲基吲哚三碳菁碘化物（DiR），随后，将DiR标记的各种NP通过尾静脉静脉内施用给GBM小鼠，并使用体内成像系统（IVIS）在施用后的不同时间点进行体内荧光成像。在脑部位出现明显的NIR荧光信号，肿瘤部位的NIR荧光信号随着时间逐渐增强，在注射后约12小时达到峰值。值得注意的是，由于双靶向方法促进了增强的肿瘤靶向能力，与SeP NP和SeP@M NP组相比，施用SeP@MT NP的小鼠在所有时间点在脑中显示出更亮的NIR荧光信号。具体地，在注射后12小时，用SeP@MT NP处理的小鼠中的NIR荧光强度分别是接受没有细胞膜伪装的SeP NP和没有T7修饰的SeP@M NP的组中的NIR荧光强度的2.2倍和1.3倍。给药后24小时，收获主要器官和脑组织。离体成像显示，与接受其他纳米制剂的GBM小鼠相比，接受SeP@MT NPs治疗的GBM小鼠脑中的红色荧光明显更强，肿瘤和其他器官中的定量荧光评估表明，SeP@中的脑肿瘤组织MT NPs组中的表达分别是SeP NPs和SeP@M NPs组的8.6倍和2.3倍。主要器官的离体成像显示，到注射后72小时，各种组织中的NP荧光信号几乎完全消失，表明SeP@MT NPs从这些器官中的有效清除。然后，将每组小鼠的脑切片并在荧光显微镜下检查。在用SeP@MT NP处理的小鼠的脑切片中，我们观察到来自DiO标记的NP的大量绿色荧光信号，主要集中在肿瘤区域，在周围正常组织中的分布最小，表明SeP@MT NP的显著肿瘤靶向和积累。另外，我们注意到DiO标记的NPs发出的绿色荧光信号与CD 31染色的脑血管发出的红色荧光信号有微弱的共定位，这表明大多数NPs已经穿透血管并浸润到血管外胶质瘤组织中，与SeP @ MT NP组相比，来自注射SeP NP或SeP@M NP的小鼠的脑切片由于其不足的肿瘤靶向能力而表现出弱得多的荧光信号。
GL 261荷瘤小鼠的体内PA成像
由于SeP@MT NPs具有突出的脑肿瘤靶向特性以及在NIR-II区域的强吸收和PA信号，我们接下来评估了它们用于体内NIR-II PA成像的潜力，以获得对脑肿瘤更全面的了解。最初，我们在各种激发波长下对携带脑肿瘤的小鼠进行了体内PA成像。在注射PBS的小鼠的脑肿瘤中没有注意到可检测的NIR-II PA信号，表明在没有PA造影剂的帮助下不能识别脑肿瘤。相反，施用SeP@MT NP导致脑肿瘤中在所有测试的激发波长上都有明显的PA信号。与680和810 nm相比，在960 nm照射下获得的PA图像显示出最高的SNR和PA强度，在680和810 nm光激发下的PA图像中观察到的显著表面背景信号这可能源于内源性吸收剂，特别是脱氧血红蛋白（Hb）和氧合血红蛋白（HbO2），因为它们在这些波长下具有很强的吸收。相反，在NIR-II PA成像场景中，由于Hb、HbO 2和水在960 nm范围内的吸收较弱，因此它们的噪声信号显著减少。最终选择960 nm激发用于体内PA成像，因为其能够从纳米探针产生稳健的PA信号，同时最小化来自内源性吸收剂的背景信号。在施用PBS、SeP NP或SeP@MT NP后的不同时间点，在960 nm激发下检测脑肿瘤内的PA信号。在脑肿瘤的高对比度PA成像方面，SeP@MT NPs优于所有其他治疗组。其信号强度在注射后12 h达到最大值，与荧光成像中观察到的趋势一致与荧光成像相比，NIR-II PA成像表现出高SNR，能够以高对比度方式精确描绘肿瘤的位置和形状，脑肿瘤内SeP@MT NPs的PA强度超过PBS和非PBS的PA强度。这些发现证明了SeP@MT NPs在体内对脑肿瘤的卓越诊断能力，这归因于它们显著的NIR-II PA效率和稳健的脑肿瘤靶向特性。
体内抗GBM疗效
使用原位GBM模型评估体内胶质瘤靶向光免疫治疗的功效。首先，建立GL 261 Luc GBM小鼠模型，并在肿瘤细胞植入后第8天随机分配到不同组JBM小鼠经历以下处理：1）PBS，2）P NP，3）Se NP + L，4）SeP NP + L，5）SeP@MT NP，和6）SeP@MT NP +每种制剂每三天静脉内给药一次，总共注射三次。在用“L”表示的组中，“脑瘤部位暴露在1064纳米激光下在光照射后，用SeP@MT NPs处理的小鼠中的肿瘤温度逐渐升高，在照射8分钟后达到峰值，为47 ℃在确认体内NIR-II PTT效应后，每3天使用IVIS进行一次生物发光成像，以跟踪脑肿瘤的进展来自脑肿瘤的体内生物发光信号表明PBS处理的对照组中的小鼠经历了快速的肿瘤生长。SeP@MT NPs和PBS组，表明这些单独的纳米制剂，在没有光照射的情况下，对肿瘤生长具有可忽略的抑制作用。Se NPs + L和SeP NPs + L组对肿瘤生长表现出一定但适度的抑制。这种有限的抑制归因于NPs穿透BBB和靶向肿瘤区域的能力不足。有趣的是，“SeP@MT NPs + L”处理显著地延缓了肿瘤生长，这由来自肿瘤细胞的最低生物发光信号证明，表明最小的肿瘤负荷。值得注意的是，在“SeP@MT NP + L”中的五只小鼠中的两只在第23天的定量分析显示，用“SeP@MT NPs +”的肿瘤生长抑制作用几乎完全抑制肿瘤生物发光信号。L-处理的结果为91.5%，超过P NP（5.8%）、Se NP + L（50.3%）、SeP NP + L（66.9%）和SeP@MT NP（13.2%）的结果。为了进一步评估治疗效果，监测各组小鼠的总体存活率，P NPs组和SeP@MT NPs组小鼠的存活时间与PBS组相比无显著差异，所有小鼠均在28天内死亡。在激光照射下，Se NPs治疗的小鼠存活37天，SeP NPs组存活48天。值得注意的是，SeP@MT NPs + L治疗明显延长了小鼠的存活时间，五分之二的小鼠存活超过60天，明显长于其他组。在整个治疗期间，PBS，PNP，和SeP@MT NPs组表现出明显的体重下降。接受Se NPs + L治疗的小鼠表现出适度的体重减轻。值得注意的是，SeP NP + L和SeP@MT NP + L组的受试者显示体重轻微增加。这些发现强烈暗示SeP@MT NP + L治疗有效减轻了脑胶质瘤的有害作用，由于其有效的抗肿瘤特性。然后我们深入研究了SeP@MT NPs在组织水平上的抗肿瘤效果。在第23天收获脑肿瘤组织，值得注意的是，施用SeP@MT NPs + L导致最显著的肿瘤生长抑制，结果在所有处理组中小鼠脑内的肿瘤负荷最小。检测不同处理后的体内GBM细胞凋亡，用SeP@MT NP + L处理在脑肿瘤组织中产生强烈的绿色荧光，表明肿瘤细胞内存在广泛的细胞凋亡。这些发现强烈暗示了SeP@MT NPs在光照射下的有效的肿瘤杀伤作用。
总结
我们已经开发了一种多功能的分级靶向纳米平台，用于GBM的NIR-II PA成像引导的光化学串联免疫治疗。通过比较具有细微单原子修饰的有机生色团，我们鉴定了一种具有上级捕光能力和增强分子运动的新型NIR-II生色团，增强光热转换和PA信号。这种高性能分子探针与热响应前药组合以配制NP，该工程策略利用了T7对BBB和GBM肿瘤上过表达的转铁蛋白受体的仿生天然同型识别和特异性亲和力，在静脉内施用到GBM小鼠模型中后，纳米剂有效地定位在肿瘤病变内并发射明亮的NIR-II PA诊断信号，其特征在于高SNR和深组织穿透，在NIR-II光照射下，温和的PTT和肿瘤特异性前药活化协同增强肿瘤细胞破坏并放大抗肿瘤免疫应答。该过程模拟“热”肿瘤免疫生态位，重塑巨噬细胞表型和刺激肿瘤特异性T细胞免疫。组合的免疫抑制作用导致GBM肿瘤的显著抑制，切除后胶质瘤复发的显著减少，以及治疗动物的存活时间延长。
参考文献
Hierarchical Targeting Nanoplatform for NIR-II Photoacoustic Imaging and Photo-Activated Synergistic Immunotherapy of Glioblastoma,Yuan Zhang, Xiaoying Kang, Jingyi Ma, Jia Li, Wenwen Chen, Shuxuan Yang, Wen Li, Yang Shi,* and Ji Qi*,Adv. Funct. Mater. 2025, 2419395,https://doi.org/10.1002/adfm.202419395
