内容提要
本文鉴定并调节红色荧光蛋白样荧光团以结合Squash，一种高度折叠的荧光RNA。其中一种荧光团DFQL-1 T在与Squash结合时表现出光稳定的NIR荧光，使活的哺乳动物细胞和小鼠中的RNA可视化成为可能。通过Squash：DFQL-1 T复合物，我们生成了基于RNA的传感器，用于检测活的哺乳动物细胞和小鼠中的非编码RNA和小分子靶标。
红色荧光蛋白的荧光团以点亮南瓜（Squash）RNA
为了创建近红外荧光 RNA 标签和基于 RNA 的传感器，我们选择了新报道的 Squash 作为荧光 RNA 适配体 。Squash 是一种高度折叠的 RNA，它能与 DFHBI（3,5 - 二氟 - 4 - 羟基苄叉咪唑啉酮）结合，DFHBI 是一种类似于绿色荧光蛋白（GFP）发色团的荧光团。因此，Squash:DFHBI 复合物是 GFP 的 RNA 模拟物，具有绿色荧光（激发波长 Ex = 428nm，发射波长 Em = 493nm）。Squash 能与 DFHO（3,5 - 二氟 - 4 - 羟基苄叉咪唑啉酮 - 2 - 肟）结合，DFHO 是一种类似于 DsRed 红色荧光蛋白（RFP）发色团的荧光团。与 DFHBI 相比，DFHO 在 C2 位置含有一个 N - 羟基亚胺（即肟），这延长了 π 电子共轭。因此，与 Squash:DFHBI 相比，Squash:DFHO 复合物显示出红移荧光（激发波长 Ex = 495nm，发射波长 Em = 562nm）（表 1）。这与经过充分研究的荧光 RNA 适配体 Broccoli 形成对比，Broccoli 能结合 DFHBI 但不能结合 DFHO，这表明 Broccoli 的荧光团结合口袋无法容纳在 C2 位置带有庞大取代基的 DFHO。这些数据表明，Squash 的荧光团结合口袋能够容纳在 C2 位置具有 π 共轭延伸的 DFHBI 衍生物。
我们考虑在 DFHBI 核心的 C2 位置进行修饰，以延长其 π 共轭，从而实现近红外荧光发射。Squash 的晶体结构表明，DFHBI 和 DFHO 中的羟基苄叉咪唑啉酮（HBI）核心负责与 Squash 结合。此外，DFHBI 衍生物中的 HBI 核心导致细胞诱导的背景较低。另外，DFHBI 的 C2 位置在 Squash 适配体中面向一个可接触溶剂的开口。基于此，我们推断在 C2 位置含有修饰的 DFHBI 衍生物仍能以较低的细胞背景与 Squash 适配。此外，DFHBI 在 C2 位置的 π 共轭延伸会导致荧光红移。因此，我们试图通过在 DFHBI 的 C2 位置添加取代基以进一步延长其 π 共轭，从而创建近红外荧光团。我们首先思考红色荧光蛋白（RFP）中的荧光团是否能与 Squash 结合并显示近红外荧光。大多数 RFP 使用的荧光团与 GFP 中的羟基苄叉咪唑啉酮类似，不同之处在于 RFP 荧光团在 C2 位置修饰有一个咪唑取代基，这延长了它们的 π 共轭。由于在 C2 位置带有肟取代基的 DFHO 类似于 DsRed 中的荧光团，但它仅显示橙色荧光。因此，我们考虑了 RFP 中其他的荧光团。我们研究了 Kaede 红色荧光蛋白中发现的各种荧光团，这些荧光团具有红移的荧光发射。因此，我们合成了多种类似这些 RFP 中天然荧光团的荧光团，称为 RFP 模拟物。我们在 C2 位置引入乙烯基咪唑或乙烯基喹啉取代基，以模拟 Kaede 的荧光团，分别命名为 DFIM 和 DFQL（。与 DFHBI 相比，DFIM（激发波长 Ex = 475nm，发射波长 Em = 568nm）和 DFQL（激发波长 Ex = 513nm，发射波长 Em = 658nm）的发射光谱分别红移了 71nm 和 161nm。值得注意的是，DFQL 显示出近红外发射荧光。我们研究了这些荧光团与 Squash 结合后是否发射近红外荧光。Squash 可以调节其结合荧光团的光谱特性。因此，我们测量了各种 Squash:RFP 模拟物复合物的荧光光谱。当与 Squash 结合时，DFAME（发射波长 Em = 621nm）、DFIM（发射波长 Em = 553nm）和 DFQL（发射波长 Em = 630nm）的发射光谱发生蓝移。Squash 中的光谱移动可能是由于荧光团与 Squash 内的核苷酸之间形成氢键或 π 堆积相互作用。
Squash:DFQL-1T 展现近红外荧光
我们通过修饰类似红色荧光蛋白（RFP）的荧光团，进一步将 Squash:RFP 模拟物的发射光谱红移至近红外区域。先前的研究报道称，将荧光团 N1 位的甲基取代基替换为三氟乙基取代基会导致发射光谱红移。例如，DFHBI-1T 的发射光谱相比 DFHBI 红移了 6nm（表 1）。此外，Squash:DFHBI-1T 复合物的发射光谱相比 Squash:DFHBI 红移了约 10nm（表 1）。而且，Squash:DFHBI-1T 的荧光强度相比 Squash:DFHBI 增强了 1.39 倍（表 1）。因此，我们合成了上述在 N1 位带有三氟乙基取代基的 RFP 模拟物（RFP-mimics-1T），包括 DFHO-1T、DFAME-1T、DFIM-1T 和 DFQL-1T。与 Squash:RFP 模拟物相比，包括 DFHO-1T、DFAME-1T、DFIM-1T 和 DFQL-1T 在内的 Squash:RFP-mimics-1T 的发射光谱分别红移了 7nm、7nm、17nm 和 24nm。Squash:DFQL-1T 复合物的发射峰达到了近红外区域（激发波长 Ex=516nm，发射波长 Em=654nm）。此外，与所有其他已报道的荧光 RNA 系统相比，Squash:DFQL-1T 复合物展现出最大的斯托克斯位移（138nm）。接下来，我们探究这些 Squash:RFP-mimics-1T 复合物在体外是否比 Squash:RFP 模拟物复合物具有更高的荧光亮度。我们测量了添加体外转录的 Squash RNA 后，不同 RFP 模拟物或 RFP-mimics-1T 的荧光强度。与原始的 Squash:RFP 模拟物复合物相比，Squash:RFP-mimics-1T 的荧光强度提高了 1.3 至 1.5 倍。这种亮度的增加主要归因于荧光量子产率（Φ）的提高。特别地，近红外荧光的 Squash:DFQL-1T 复合物的量子产率为 0.14，与其他已报道的近红外荧光蛋白相当或更高，包括 iRFP670（Φ=0.12）、iRFP682（Φ=0.11）、iRFP713（Φ=0.063）。这些结果表明，用三氟乙基取代 N1 位的甲基会导致荧光亮度增加。为了确定 RFP-mimics-1T 荧光团是否能增强细胞内 Squash 的荧光亮度，我们使用 Tornado 表达系统在 HEK293T 细胞中表达 Squash，该系统可使 Squash 作为环状 RNA 高水平表达。在成像前 1 小时，我们将培养基替换为含有每种荧光团（2μM）的无酚红培养基。这些 RFP-mimics-1T 或 RFP 模拟物荧光团在对照的 HEK293T 细胞中显示出低细胞背景，在表达 Squash 的 HEK293T 细胞中显示出高荧光。此外，与相应的 RFP 模拟物相比，RFP-mimics-1T 显示出更高的由 Squash 诱导的荧光。这些 RFP-mimics-1T 在表达 Squash 的 BL21 大肠杆菌细胞中也显示出高荧光（。特别地，我们发现 DFQL-1T 单独在对照细胞中显示出低背景，在表达环状 Squash 的细胞中相比 DFQL 显示出高近红外荧光这是因为 Squash:DFQL-1T 相比 Squash:DFQL 具有更高的绝对亮度，而不是更高的热稳定性。
活哺乳动物细胞及体内细胞内小分子的近红外成像
我们利用 Squash:DFQL-1T 复合物设计了用于小分子成像的近红外荧光传感器。为此，我们分别将 Squash 改造成四环素传感器和 S - 腺苷甲硫氨酸（SAM）传感器。这些传感器由四环素结合适配体或 SAM - III 核糖开关通过一个转换结构域与 Squash 融合而成。转换结构域是一个热力学不稳定的螺旋结构，因此在没有目标小分子存在时处于未折叠状态。然而，一旦与目标结合，转换结构域就会正确折叠，从而变构诱导 Squash 折叠。我们分别测定基于 Squash 的近红外荧光传感器能否在体外检测 SAM 和四环素。在先前的研究中，报道了带有转换结构域 1 的基于 Squash 的 SAM 传感器在检测 SAM 时荧光可增强 5 倍。为了进一步优化 SAM 传感器，我们设计了几个具有不同热力学稳定性的转换结构域。然而，先前报道的带有转换结构域 1 的 SAM 传感器仍具有最佳的信噪比（图 6c）。接下来，我们专注于优化基于 Squash 的四环素传感器。最佳的四环素传感器在与四环素结合时荧光增强了 14 倍。此外，基于 Squash 的 SAM 传感器和四环素传感器都具有很高的特异性。
我们表达基于 Squash 的传感器，以在 HEK293T 细胞中对其目标分子进行成像。在与 DFQL - 1T 孵育后，表达四环素传感器的细胞在没有四环素存在时荧光很弱。当与含有四环素的培养基孵育时，表达四环素传感器的 HEK293T 细胞在 25 - 250μM 范围内呈现出剂量依赖性的荧光增强（图 6d 和补充图 13），这与先前的报道一致。在表达 SAM 传感器的细胞中，我们观察到强烈的近红外荧光，这表明基于 Squash 的 SAM 传感器能够在活细胞中对内源性 SAM 进行成像。在用 SAM 合成抑制剂环亮氨酸（30mM）孵育后，表达 SAM 传感器的细胞中近红外荧光降至最低水平。去除环亮氨酸后 3 小时内，细胞荧光得以恢复。此外，我们还利用基于 Squash 的近红外传感器对细菌细胞中的四环素进行成像，并监测 SAM 的生物合成（。这些结果共同证实，基于 Squash:DFQL - 1T 的近红外荧光传感器能够在活细胞中对小分子进行成像。我们还测定了这些传感器能否在活小鼠中对小分子进行成像。将表达四环素传感器或 SAM 传感器的工程化 HEK293T 细胞用相应的目标分子处理，然后将这些细胞移植到活小鼠体内。正如预期的那样，移植了经四环素处理细胞的小鼠表现出可检测到的近红外荧光，而用载体处理的小鼠近红外荧光很弱。在移植了表达 SAM 传感器细胞的小鼠中，我们很容易检测到 Squash 的近红外荧光。我们观察到，移植了经环亮氨酸处理细胞的小鼠近红外荧光减弱。因此，这些数据表明，基于 Squash 的近红外传感器可广泛用作体内小分子成像平台。
结论
本研究通过合理设计与 Squash 结合的荧光团，将发出绿色荧光的 Squash 转变为发红光和近红外光的 RNA 标签。基于 Squash 的晶体结构以及红色荧光蛋白发色团的化学结构，我们开发了 DFQL-1T，一种类似于 Kaede 红色荧光蛋白的荧光团，它能够以低背景和明显的近红外荧光点亮 Squash。利用 DFQL-1T，我们能够在近红外通道中轻松实现体内 RNA 成像。此外，我们构建了多种基于 Squash 的近红外荧光传感器，用于在活小鼠体内检测非编码 RNA 和小分子。
参考文献
Near-infrared fluorogenic RNA for in vivo imaging and sensing,Zhenyin Chen, Wei Chen, Cun Xu6, Haozhi Song, Xin Ji , Haodong Jiang, Hongtao Duan, Zehao Li, Wankai Gao, Tuoxin Yao, Zhongxuan Zhang, Liuqin He, Yulong Yin, Nanyang Yang, Wenjing Tian , Jiahui Wu & Xing Li,Nat. Communi | (2025) 16:518,https://doi.org/10.1038/s41467-024-55093-1
