双光子光动力疗法（TP-PDT）特别是由第二近红外（NIR-II）光激发的双光子光动力疗法（TP-PDT），由于其PDT和TP激发的组合优点，为解决这一挑战提供了前所未有的机会。高性能光敏剂（PS）的缺乏也阻碍了TP-PDT在GBM上的进展。通过将多种有益的设计策略精心集成到单个分子中，特意构建了一种强大的TP-PS，称为MeTTh，同时实现了优异的NIR-II激发、大吸收截面、聚集诱导的NIR-I发射 ，以及显着的 I/II 型活性氧生成，实现了940 μm 的大脑结构成像深度。MeTTh纳米粒子在1040 nm飞秒激光照射下顺利地对体内小尺寸GBM进行精确有效的治疗。
化合物的合成和光物理化学性质研究
选择甲基取代的二苯胺（mTPA）作为主要电子供体，噻吩作为��桥和附加电子供体，绕丹宁作为强受体，从而组成化合物MeTTh。 因此，绕丹宁片段的平面性以及噻吩共轭提供了相对平坦的分子构型，有利于TP吸收。MeTTh上强大的 D-A 效应进一步确保了 2PACS，同时促进高效的 ISC 流程。为了确保 FL 亮度，mTPA 还充当强大的转子和垫片，防止分子 π-π 堆积，从而有助于实现良好的 AIE 效果。用紫外可见光谱和光致发光光谱表征了MeTTh的光学性质。如图所示，二甲基亚砜(DMSO)中MeTTh的最大吸光度为511 nm，发射峰为782 nm。这种荧光光谱主要位于适合于高性能FL生物成像的NIR-I区(700-950 nm)。MeTTh的FL峰随着溶剂极性的增加而逐渐红移，表明ICT效应很强。通过比较MeTTh在不同含水率(FW)的DMSO/水混合物中的荧光光谱，研究了MeTTh的AIE特征。如图S12(辅助信息)所示，MeTTh在低FW的溶剂中表现出非常弱的发射，这是由于分子内运动主导的能量消耗。然而，MeTTh的荧光强度随着FW值的增大而急剧增强，验证了RIM效应所引起的典型的AIE行为。推测MeTTh优良的AIE倾向源于MTPA上较大的二面角，抑制了有害的分子间堆积。接下来，为了赋予MeTTh水分散性，并将其应用于生物医学领域，采用经典的纳米沉淀法，利用两亲性聚合物DSPEPEG2K将MeTTh包埋在纳米粒子中。测得纳米粒子的流体力学尺寸为106 nm，略大于透射电子显微镜分析的∼(71 Nm)。根据标准曲线计算出MeTTh的包封率为∼90%。与MeTTh在DMSO中的单分子状态相比，MeTTh纳米粒子在500 nm处有轻微的蓝移吸收峰，在690 nm处有蓝移的发射峰。
为了评估 MeTTh NP 的光动力效应，使用 FL 指示剂 2',7'-二氯二氢荧光素 (DCFH) 来研究总体 ROS 产生率。 在 MeTTh NP (2 μM) 存在下观察到 DCFH 的 FL 显着增加，远远大于商业 PS、Ce6 所实现的增加。 此外，DCFH 强度与 MeTTh NP 的浓度呈正相关。 接下来，使用不同的ROS探针，包括羟苯基荧光素（HPF）、二氢罗丹明123（DHR123）和9,10-二甲基蒽（ABDA）分别指示·OH、O2·−和1O2的生成率。在 MeTTh NP 存在的情况下，HPF 和 DHR123 的 FL 在白光照射下显着增加。 MeTTh NPs 介导的 ABDA 降解率低于 Ce6。 这些结果表明 MeTTh NPs 具有较高的 I 型 ROS 生产率。为了验证 MeTTh 的 TP 性质，使用飞秒 FL 激发方法以罗丹明 B 作为标准 TP 染料测量其 2PACS。 如图所示，MeTTh NP 在 800 至 1080 nm 范围内表现出 U 形 2PACS 光谱范围，在 820 nm 和 1060 nm 处分别具有两个大 2PACS 值 1837.85 和 1802.37 GM，比罗丹明 B 显着得多。 结果与图中的模拟结果遵循相同的趋势。 虽然单光子吸收峰位于 500 nm，但 2PACS 峰并不正好是 500 nm 的两倍。
MeTTh NPs-Tf 的体外研究
受益于良好的TP特性和显着的光动力效应，MeTTh NPs可用于消融GBM 261细胞（GL261）肿瘤细胞。 为了赋予对GBM的靶向能力，在MeTTh NPs的表面修饰了Tf。 流体动力学尺寸和 zeta 电位值的变化表明 Tf 的成功修改。 为了确保这种表面修饰不会损害稳定性，使用超纯水、PBS 和 DMEM 作为溶剂连续监测 MeTTh NPs-Tf 的流体动力学尺寸、吸收和发射。 图S21（支持信息）显示了流体动力学尺寸的最小变化，图S22（支持信息）显示了第一周内相对稳定的光学特性。 因此认为MeTTh NPs-Tf在生理环境中具有令人满意的稳定性。 然后研究细胞摄取以证明 MeTTh NPs-Tf 对 GL261 细胞的靶向能力。 共焦激光扫描显微镜（CLSM）图像和流式细胞术分析结果表明细胞中MeTTh NPs-Tf的积累增强，与MeTTh NPs处理组形成鲜明对比。 TP FL成像进一步证实了MeTTh NPsTf对GL261肿瘤球体的靶向能力。 MeTTh NPs-Tf 组的 FL 强度和覆盖范围均比 MeTTh NPs 组强得多。 使用各种途径抑制剂进一步评估内吞途径（图S24，支持信息）。 细胞对NPs的摄取在4℃下几乎被抑制，并部分受到氯丙嗪和制霉菌素的限制，其中氯丙嗪表现出更强的抑制作用，表明网格蛋白介导的内吞作用是主要途径。在激光照射下评估经 MeTTh NPs-Tf (10 μM) 处理的 GL261 细胞的细胞内 ROS 生成。在常氧和缺氧条件下光照射后，GL261细胞中观察到DCFH的明亮荧光，证实了MeTTh的I型性质。 值得注意的是，常氧组的 DCFH 强度强于缺氧组。 这种差异归因于在常氧环境下 MeTTh NPs-T 联合产生 I 型和 II 型 ROS。 此外，在 1040 fs 激光照射下评估了 MeTTh NPs-Tf 在 GL261 细胞中的 TP 光动力效应。 如图2c所示，随着照射时间的延长，DCFH的绿色TP FL出现并明显增加，表明细胞内ROS的有效产生。 更重要的是，照射4分钟后，细胞表面出现了广泛的小泡（白色箭头所示）。 这种现象是PDT的典型征兆。 相反，没有 MeTTh NPs-Tf 的 GL261 细胞在 FL 发射方面没有表现出明显的变化。
脑脉管系统 TP FL 成像
为了评价MeTh NPs-Tf的成像性能，在有颅窗的C57小鼠上进行了小鼠脑血管的活体TP FL成像。在体内应用之前，进行了溶血实验，以研究MeTh纳米粒-转铁蛋白的生物相容性。如图S32(辅助信息)所示，由于公认的生物兼容聚乙二醇表面层的保护，即使在100μM的高浓度甲基四氢呋喃纳米粒子-Tff的保护下，也观察到有限的溶血率(低于5%)。MeTh纳米粒-转铁蛋白的生物惰性使其适合在体内应用。然后，给小鼠静脉注射10 mg kg−-1的MeTh NPs-Tf。然后用1040 nm飞秒激光通过水浸物镜(40×，NA：0.95)聚焦于脑血管以激发TP。源于MeTTh NPs-Tf的亮红色FL出现在不同深度的脑血管中。可以辨认出大脑浅层区域的大血管和深部脑内的微小毛细血管。因此，基于不同深度的一系列2D图像重建了脑血管的3D图像。值得注意的是，MeTh NPs-Tf实现了940μm的超深TP成像。这种性能接近1040 nm飞秒激光TP成像的理论极限。提取具有特定深度范围的不同成像片段并显示在图3b中。TP图像的背景噪声随着深度的增加而明显增大。在850-940μm的成像段，大多数毛细血管变得难以辨别，从而阻止了我们进一步观察脑深部。为了更好地说明TP FL在大脑中的成像性能，在图3中总结了特定深度的信号背景比(SBR)和使用的功率。在浅层大脑区域，使用了大的SBR值和低的激光功率，这意味着生物组织的光散射可以忽略不计，MeTh NPs-Tf很容易被激发。随着成像深度的增加，SBR值和激光功率呈相反方向变化。特别是在大脑深处使用了80 mW的激光功率；然而，它只在940μm的深度产生了非常低的SBR1.6，这表明生物组织中存在严重的光散射。为了更好地理解SBR值的意义，在图中绘制了血管在80、400、600和875μm成像深度处的FL强度的直线分布，计算结果分别为49.8、13.0、4.5和2.2.很容易观察到，信号强度保持在相同的顺序，而背景噪声显著增加，从而降低了SBR值。
脑 GBM 体内TP-PDT
为了观察GBM和MeTTh NPs-Tf之间的相互作用，采用TP刺激后发出绿色FL的GFP-GL261细胞建立GBM动物模型。给小鼠静脉注射−-1，剂量为10 mg·kg-1。然后用1040 nm飞秒激光通过空气物镜(10×，NA：0.5)同时激发MeTh NPs-Tf和GBM。如图4a所示，显微镜下可见不同的绿色和红色FL，代表血管和基底膜。基底膜的大小被测量为最小长度为1000μ，宽度为640μm，代表了手术后残留的一个很好的例子。绿色和红色FL通道在图4b，c中分别显示，确认没有发射干扰。有趣的是，可以很容易地注意到，与没有肿瘤的小鼠相比，基底膜区域附近出现了大量的血管。这一现象可以用肿瘤血管生成效应来解释，该效应旨在为肿瘤提供营养和氧气，以维持最佳生长。深入观察TP图像，可以观察到小血管和毛细血管嵌入基底膜。进一步计算了图中选定的毛细血管的直径。如图所示，根据FL曲线图的半高宽曲线观察到g、5.5和4.3FWHM m直径。血脑屏障是一种高度选择性的半透性细胞层，控制着循环系统和中枢神经系统之间的溶质和化学物质的通道。尽管Tf被报道为一种可行的蛋白质，可以穿透血脑屏障并在GBM中蓄积，但我们的初步实验表明，考虑到有效的PDT所需的NPs的浓度，MeTTh NPs-Tf在体内不能有效和可靠地靶向GBM。为了解决这个问题，FUS结合微泡应用于肿瘤区域，并瞬时打开血脑屏障，以增加局部MeTTh NPs-Tf的浓度。如图4h所示，一旦FUS运行，在视野中观察到由超声波引起的一系列条带。从那时起，可以直观地看到MeTTh NPs-Tf从血管中的释放或扩散，如白色虚线框所示。以前的研究表明，在FUS手术后近4小时，血脑屏障将关闭，这表明该技术的使用是安全的。[29]在注射NPs后24小时，观察到基底膜周围有效的NPs释放(图S36，支持信息)。此时，在双光子显微镜下使用浸水物镜监测局部GBM区域，并重建成3D图像。如图所示，绿色FL GBM组织附近出现广泛的红色FL点，验证了MeTh NPs-Tf的靶向能力。为了更好地了解MeTTh NPs-Tf在GBM中的位置，分析了特定深度的TP FL图像。Red FL主要位于GBM区域，在肿瘤周边区域不存在，表明MeTTh NPs-Tffst首先穿过BBB，然后进入GBM。白虚线主要代表血管面积。由于此时循环系统内几乎没有MeTh NPs-Tf，因此无法再检测到血管。进一步捕捉GBM细胞的放大的TP FL图像，以确定MeTTh NPs-T在细胞一侧的位置。如图4K所示，MeTh NPs-Tf出现在细胞核周围，类似于使用贴壁细胞成像的结果。上述结果证明了MeTh NPs-Tf的靶向性，为后续的体内TP-PDT奠定了坚实的基础。
总结
在本研究中，我们成功地设计并合成了一种高性能的双光子光疗试剂MeTTh。由于其固有的结构特征，包括良好的受主平面性、扩展的��共轭和较强的D-A相互作用，在近红外-Ⅱ区显示出较大的双光子吸收截面和强大的光动力学效应，为TP-PDT提供了坚实的基础。MeTTh的扭曲构象和可自由旋转的部分确保了聚集态的适度亮度，从而促进了有效的双光子荧光成像引导光疗。经双光子成像证实，当形成纳米粒子并用转铁蛋白修饰后，所获得的MeTThNPs-Tf在聚焦超声介导的BBB开放过程中有效地靶向原位小尺寸的GBM。在1040 nm的NIR-II飞秒激光照射下，使用MeTTh NPs-Tf实现了对小尺寸GBM的精确和高效的TP-PDT，从而显著抑制了肿瘤的生长。此外，MeTh NPs-Tf在脑血管系统显示了940μm的非凡成像深度。通过全面的体外和体内评价，彻底检查了MeTh纳米粒-Tf的安全性。
参考文献
An NIR-II Two-Photon Excitable AIE Photosensitizer for Precise and Efficient Treatment of Orthotopic Small-Size Glioblastoma，Zhourui Xu, Xue Li, Zengming Yang, Zhijun Zhang, Yibin Zhang, Miaozhuang Fan, Yuying Zeng, Miaomiao Kang,* Yuanyuan Shen,* Dong Wang,* Gaixia Xu, and Ben Zhong Tang，Adv. Mater. 2024, 2413164，https://doi.org/10.1002/adma.202413164
