内容提要
短波红外（SWIR）区域是下一代生物成像的理想光谱窗口，以利用改进的穿透性和降低光毒性。SWIR光谱活性也可以通过超分子染料聚集获得。不幸的是，染料聚集的发展仍然具有挑战性。我们提出了一种晶体辅助骨料合成（CAASH）方法，为j骨料的开发和双苯环罗丹明硅支架（ESi5）的水溶性SWIR jv骨料的成功开发提供了一层合理性。所得到的swr -聚集体对有机溶剂、pH值、超声、光漂白、硫醇和内源性氧化物质具有优异的稳定性。值得注意的是，聚集体具有较高的结构依赖性熔融温度，约为330-335 K。事实上，加热/退火工艺可以用来降低聚集无序性。
设计指导方针
ESi5是一种吸收867 nm波长的明亮阳离子荧光团，我们的设计从ESi5的结晶开始。有趣的是，当使用不同的反离子时，得到了两种不同的ESi5晶体结构。在Cl−中，ESi5堆叠成传统的砖砌j型聚集壁，并进一步与其他壁以h型排列，形成3D晶体堆积。按照文献惯例，这样的包装被称为HJ-aggregate64。对于PF6−，ESi5采用不同的锯齿形链内填充模式，两个近端染料之间的夹角为121.1°。这种斜二聚体在图示上称为v -二聚体。当两壁共面结合时，其链间充填方式不再是h型，而是j型，滑移角为51.7°。由于这个原因，这个聚合被称为JVaggregate。假设我们可以一层一层地把晶体剪掉，直到最后两层，这两层通过π -π相互作用堆叠在一起。为了进一步呈现这种两层堆叠的稳定性和在水介质中的生物相容性，可以在染料的电子推拉头基团上安装两个柔性亲水性链。根据这个想法，我们用叠氮基团取代了ESi5的两个氯原子，并进一步将其点击到与各种水溶性基团相连的末端炔。这种合理功能化的两亲性ESi5有望在水介质中自发聚集。然而，特定的聚集结果，例如hj型，jv型或任何其他意想不到的方式，都是偶然的，但可以通过将它们的吸收光谱特征与晶体结构中的堆积方式相关联来推断。对于ESi5，单个红移（或蓝移）峰表示J-（或H-）聚集体，而v -聚集体则通过能量分裂导致红移峰和蓝移峰。两个峰的相对强度取决于它们之间的夹角。假设角度（α）保持在约120°，根据fJ/fH = tg2 (α/2)67，预计j波段（fJ）的振荡强度大约是h波段（fH）的三倍。
光物理性质
ESi5的荧光色核心是阳离子的，阴离子末端的安装导致两亲性，从而在水介质中产生聚集的驱动力。我们制备了8种具有不同水溶性基团的ESi5衍生物，即带有两性离子的ESi5- ns，带有季铵的ESi5- n，带有磺酸盐的ESi5- s，带有1-5个碳原子的羧酸包覆的线性烷基链的ESi5- c1 (-C5)。绘制了每一种材料的表面静电电位，以定性地评估它们聚集的潜力。将每种化合物（5 mM, 2 μL）的MeOH等分物加入到H2O （2 mL）中搅拌，无需再静置，即可获得其UV-Vis吸收光谱。ESi5-NS和ESi5-N未观察到聚集形成的光谱特征。在含有ESi5- ns的溶液中逐渐加入200 mM的NaCl，会导致ESi5染料的光谱蓝从867 nm移到744 nm，这表明形成了不希望的h型聚集体（表1）。这种ESi5- ns的h型聚集体是非荧光的。ESi5-N即使在NaCl （200 mM）存在下也不会聚集，这可能是由于它的三阳离子特性。与之形成鲜明对比的是，ESi5-S和ESi5-C1（-C5）在将其MeOH原液加入H2O后瞬间聚合。它们的吸收光谱表现出相似的光谱特征，即在1098 nm处有一个强度较低的红移峰，在1038 nm处有一个强度高得多的红移峰，在696 nm处有一个强度与1098 nm相当的蓝移峰，并且在696 nm和1038 nm之间有非分辨的振动带。
对骨料充填方式的明确解析仍然是该领域的一大挑战。CAASH方法的一个优点是单体染料的晶体结构提供了可靠的参考来源。这样的三峰格局不可能是图中的hj型填料的结果，但与图中的jv型填料是一致的。1038和696 nm处的两个波段可能是由于ESi5的链内v聚集，因为它们的振荡强度约为3:1。1098 nm处剩余的最红峰必须是链间二维j聚集的结果。峰宽是偶极耦合强度的一个指标，通过谱反褶积计算。在696 nm、1038 nm和1098 nm处，三个峰的FWHM分别为574.0 cm−1、452.6 cm−1和233.3 cm−1，表明近端ESi5染料之间存在很强的偶极耦合。在ESi5-S agg或ESi5-C1(-C5) agg溶液的696 nm、1038 nm和1098 nm光激发下，在约1106 nm处观察到相同的共振荧光发射带，FWHM非常明显，为481.9 cm−1（表1）。ESi5-S的荧光量子产率为0.06%，与单体的1.7%相比显著降低。通过瞬态吸收研究，计算出58 ps的荧光寿命。末端阴离子由磺酸盐转变为羧酸盐，导致两个红移峰之间的光谱分辨率略有降低，而1038 ~ 696 nm之间的小振动峰增强。从ESi5-C1的-CH2-增加到ESi5-C5的-(CH2)5-的烷基链长度导致吸收带略有变宽。
关于聚合的控制参数
以ESi5- s agg为例，全面评价了ESi5染料聚合体对有机溶剂、染料浓度、超声、pH、温度、光照和氧化剂的稳定性。获得ESi5-S agg （5 μM）在中性PBS缓冲液和不同浓度的MeOH （0% ~ 32%, v/v）混合物中的紫外-可见吸收光谱。当MeOH浓度低于6%时，吸收光谱基本保持不变。当MeOH浓度超过6%时，聚合体的峰开始降低，单体在867 nm处的峰开始升高。当甲醇浓度为22%时，观察到50%的聚集。将MeOH浓度提高到32%以上，最终完全抑制了jv聚集体的形成。ESi5-S表现出较高的聚集倾向。在文献中，通常使用10−4 -10−3 M−1的高浓度染料来促进聚集。而ESi5-S即使在1 μM也完全汇聚。进一步增加染料浓度，相对于染料浓度，696、1038和1098 nm处的吸光度呈线性增加，测试达到30 μM。该实验有助于确定生物成像的理想浓度。
研究了ESi5-S （5 μM）溶液在PBS和5% MeOH溶液中的温度依赖性。当温度从室温逐渐升高到90℃时，αagg的聚集度（αagg）从25℃时的接近一致下降到90℃时的约2.8%。αagg = 50%时，其熔融温度Tm为74℃。当溶液温度从90℃进一步降低至25℃时，骨料的吸收基本恢复。有趣的是，1038 nm和1098 nm处的吸收带变窄，两者的间距变宽。
可能加热/退火工艺消除了一些聚集缺陷，并进一步增强了偶极耦合。然后，我们重复加热/退火过程超过20次，该系统显示出优异的可逆性。该实验不仅突出了聚集体的稳定性，而且还体现了单体ESi5染料在苛刻条件下的高稳定性，即在75°C的PBS中放置数小时。计算得到ESi5-S聚集体的平衡常数Ke和Gibbs自由能ΔG分别为8.2 × 105 M−1和−36.6 kJ•M−1。将ESi5-S的磺酸盐转变为ESi5-C1的羧酸盐，导致Tm略微降低至69°C， Ke略微降低至7.1 × 105 M−1，ΔG略微降低至−36.2 kJ•M−1。烷基链的进一步延伸导致聚体稳定性进一步显著降低。ESi5-S agg的加热退火结果促使我们想知道同样的方法是否可以应用于ESi5-C1(-C5)，因为它们的聚集无序似乎比ESi5-S更明显。ESi5-C1（-C5）聚集体溶液在PBS中加入5%的MeOH，加热至90℃，然后冷却至室温。效果非常明显。三个主要波段在约1098 nm，约1038 nm和约696 nm的形状变得更锐利。两个光谱上无法分辨的红色波段现在完全分辨出来了。两个红带红移约8 nm，蓝带蓝移约12 nm。这些都是总体紊乱减少的迹象。ESi5-S agg对超声和pH变化也很稳定。
活体荧光成像
我们进一步测试了ESi5-S agg在体内荧光成像的可行性，利用其强窄带SWIR吸收和在水介质中的高稳定性。注射时，聚集体被稀释，并在血管中重新建立聚集-分解平衡。因此，可以进行双通道成像实验来监测聚集体（λex = 1064 nm）和解离单体（λex = 808 nm）的荧光。由于聚合体和单体在大小、电荷和形态上有很大的不同，因此它们预计会表现出不同的代谢特征和体内分布。我们进一步验证了聚集体可以被1064 nm激光选择性激发，单体可以被808 nm激光选择性激发，串扰最小。将等分ESi5-S agg溶液（500 μM PBS, 100 μL）通过尾静脉注射到BALB/c小鼠体内，最终血管浓度为2.5 mg/kg，相当于约30 μM的生物相容血药浓度。第一组图像是在注射后10分钟拍摄的。聚集体的荧光信号来自肝脏、脾脏和骨骼等器官，而单体的信号则局限于肝脏。两条通道均未见血管。这表明聚集体即使在血液中也表现出显著的抗解离稳定性，并通过循环分布。它对骨的亲和力可能是由于它的聚阴离子性质。由于其对羟基磷灰石的亲和力，这种骨亲和性也与许多其他聚阴离子材料一致。椎体与软组织之间的荧光强度之比在180 min内达到3.9的峰值。此外，跨越椎骨和胫骨的分析也显示出骨与其他部分的良好区分，FWHM分别为0.89 mm和1.80 mm。在180 min的过程中，间歇地获得这两个通道的荧光图像。除信号强度逐渐减弱外，其分布格局基本不变。两个通道的肝脏区域的荧光图像可以很好地估计单体和聚集体的代谢动力学，大约需要几个小时。这表明聚集体的解离和代谢是逐渐的。在180分钟内，该单体从肝脏代谢到肠道。线强度剖面可用于计算各种解剖结构的大小，例如胸骨约0.89 mm，胫骨约1.80 mm。同样，俯卧状态的成像也显示了正常骨骼的高灵敏度和SBR，包括腰椎、髂骨、尾椎和股骨。具体而言，提取沿腰椎的线强度分析（红线），并提供1.12-1.63 mm范围内所有椎骨的尺寸。除肝脏外，其他器官缺乏单体信号，表明聚集体的解离主要发生在肝脏。
体内光声成像
ESi5-S agg溶液在PBS中的升温曲线与聚集体浓度和激光功率密度相关。对光热转换曲线的拟合得到了58.1%的光热转换效率。此外，通过在25-46.6°C范围内反复加热/冷却循环来评估ESi5-S agg的热稳定性。5个循环后，没有观察到疲劳迹象，而IR-1061在相同条件下的2个加热/冷却循环中没有存活下来。进一步测试了ESi5-S agg在不同浓度（0-50 μM）下的光声效应。光声强度与ESi5-S agg浓度呈剂量依赖性。光声信号强度是IR-1061 （50 μM PBS）的3.5倍。用BALB/c小鼠进行了ESi5-S agg在体内光声成像的可行性研究。首先，在不注射ESi5-S agg的情况下，获得小鼠的背景光声成像。来自富血管区/器官的微弱信号的存在是由于该SWIR区域对血红蛋白的微弱吸收。将ESi5-S agg溶液（2.5 mg/kg）加入PBS，经尾静脉注射BALB/c剃毛小鼠。由于其在1064 nm处的强吸收，可以获得血红蛋白信号的良好对比度。180 min后，在1064 nm激发下进行光声实验，重建三维光声层析成像。光声信号集中在肝脏和骨骼（包括胸骨、肋骨和腰椎），与荧光成像结果一致。对于腰椎，沿腰椎垂直和水平分析（ROI 1和ROI 2）分别出现8个和3个光声强度峰，fwhm足够高，可以区分包括后关节突在内的不同椎体。从上述实验结果可以看出，ESi5-S具有优异的PA成像性能。
结论
我们选择ESi5作为单体染料来开发SWIR聚集体，因为它满足基本标准：(1)由于大的跃迁偶极矩，在867 nm处深近红外吸收最大；(2)平面电子推拉头组；(3)共轭主链中心有粗大的基团。在ESi5框架上实现CAASH方法是一个两步的过程。首先，通过生长裸骨ESi5荧光团的晶体来评估ESi5形成聚集体的倾向。有趣的是，当使用不同的反阴离子时，我们成功地获得了两种不同的ESi5晶体。随着第一步的成功，我们随后在ESi5支架的电子推拉头组上安装了两条亲水链，以增加在水介质中聚集的额外驱动力。将两亲性ESi5染料（如ESi5- s或ESi5- c1 (-C5)）加入水中后，立即观察到表明形成聚集体的光谱特征。ESi5单体在867 nm处的强吸收消失，在696、1038和1098 nm处出现了三个新的峰。结合ESi5晶体的基本激子理论和晶体填充方式，可以推断出696和1038 nm波段可能来自链内v聚集，1098 nm波段可能来自链间j聚集。在光激发下，ESi5聚集体表现出尖锐的共振荧光发射带和大大降低的荧光寿命。从ESi5染料中获得的jv -聚集体对有机溶剂、温度、光漂白和活性化学物质表现出意想不到的高稳定性。值得注意的是，我们发现加热/退火不仅不会导致jv -团聚体的破坏，而且有助于减少团聚无序性，提高团聚耦合强度。ESi5-S agg具有较高的生物相容性，如高水稳定性、水溶性、低毒性和低溶血能力
参考文献
A stable and biocompatible shortwave infrared nanoribbon for dual-channel in vivo imaging,Cheng Yao , Ruwei Wei, Xiao Luo , Jie Zhou,Xiaodong Zhang, Xicun Lu,Yan Dong, Ruofan Chu, Yuxin Sun, Yu Wang,Wencheng Xia6 , Dahui Qu,Cong Liu , Jun Ren, Guangbo Ge, Jinquan Chen , Xuhong Qian,& Youjun Yang ,Nat.Commun.| (2025) 16:4,https://doi.org/10.1038/s41467-024-55445-x
