内容提要
我们以提供苯稠合的Cy5 二聚体 (Cy-D-5)，以协同促进 PDT/PTT 应用。Cy-D5 在磷酸盐缓冲盐水中表现出形成 J-聚集体和 H-聚集体的趋势，其显示出长波长吸收带红移至 810 nm，短波长吸收带红移至745 nm， 分别与其在乙醇 (778 nm) 中的行为进行比较。密度泛函理论计算表明融合二聚体 Cy-D-5 具有低 ΔEST (0.51 eV) 和高效的非辐射跃迁率（比临床批准的 PS 高 12.6 倍）。与ICG相比，Cy-D-5表现出更高的产生1O2的光敏能力、更强的光热转换效率（η = 64.4%）和更高的光稳定性。 这些综合特性使 Cy-D-5 在 808 nm 激光照射下能够实现肿瘤的完全消融，凸显了其作为强大的双功能光治疗剂的潜力。
Cy-D-5的合成与光谱性质
二聚花菁染料是通过中心苯桥与两个相互作用的发色团合成的。我们选择 Cy5 作为单体，因为它比 Cy7 具有更高的光稳定性。 此外，Cy-D-5 中苯环的稠合将波长吸收扩展到近红外区域。 在二聚体花青染料中，具有两个共价连接的发色团的聚次甲基染料由于发色团相互作用而经历激发态的激子分裂 ，随后较低的单重激发态 (S1) 和三重激发态之间的能隙减小 状态（T）水平。 这可能会提高系统间穿越 (ISC) 的速度。此外，与初始单体染料相比，二聚体花青染料具有更长的共轭结构，这有利于诱导从荧光到非辐射跃迁的光转换。
Cy-D-5在乙醇(EtOH)中在778 nm(ε=31.9×104M−1 cm−1)处有强吸收，在801 nm(ΦF=0.9%)处有很弱的荧光。参比ICG在乙醇溶液中在788 nm处有较强的吸收(ε=26.1×104M−1 cm−1)，在815 nm处有较强的荧光(ΦF=7.6%)。然而，在磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液中，吸光度明显下降，这应归因于分子的聚集。与其在乙醇中778 nm处的吸收光谱相比，Cy-D-5在PBS中表现出较宽的吸收光谱，在810 nm和745 nm处有两个明显的峰值。在这个更宽的光谱中，810 nm处的峰相对于乙醇的最大吸收峰略有红移，而745 nm处的峰明显蓝移。y-D-5在PBS中倾向于同时形成J-聚集体和H-聚集体。通过观察乙醇和PbS中Cy-D-5的发射峰，进一步证明了这些偏色位移。由于 π 离域系统的延伸，Cy5 与 Cy-D-5 的共轭耦合导致近红外区域的吸收明显红移。与 Cy5 单体相比，Cy-D-5 的光谱显示出向近红外区域的显着红移。
Cy-D-5的体外活性氧及光热转换性能
使用荧光探针单线态氧传感器绿（SOSG）作为 PBS 中的 1O2 捕获剂，对 1O2 的生成效率进行了实验研究。 SOSG 不发荧光，但会与 1O2 发生特异性反应，产生荧光化合物。528 nm 处产生的荧光信号强度与生成的 1O2 量直接相关。如图所示，用 808 nm 光照射含有 ICG 或 Cy-D-5 和 SOSG 的溶液，在 240 秒内导致 528 nm 处的 SOSG 荧光强度显着增加，证实了 1O2 的生成。 还进行了对照实验，其中在相同条件下仅用光照射 SOSG（不含任何敏化剂）。 该对照显示荧光没有显着增加。 图中显示了SOSG荧光强度增加的比较结果，表明Cy-D-5表现出显着增强的单线态氧生成——比PBS中的ICG大约高5.0倍。通过改变 Cy-D-5 的浓度和 808 nm 激光的能量密度来评估 PBS 中 Cy-D-5 的光热效应。 溶液的最终温度与Cy-D-5的浓度和光密度呈正相关。 此外，CyD-5的PCE（η）计算为64.4%，显着高于ICG（17.7%）。 对Cy-D-5、ICG和PBS的光热图像进行监测，进一步证实了Cy-D-5出色的PTT效果。 值得注意的是，Cy-D-5 表现出出色的热稳定性和光稳定性，在连续激光照射下加热和冷却三个循环后没有观察到降解。Cy-D-5 令人印象深刻的光热性能，其特点是在近红外区域的强吸收和高 PCE，凸显了其先进光热治疗的潜力。
体外细胞毒性与细胞定位
在 4T1 细胞中检查了细胞摄取。Cy-D-5和ICG均在4小时时达到最大荧光/摄取，表明Cy-D-5可以在4T1细胞中有效积累。 随后，通过MTT法检测Cy-D-5和ICG的体外光疗效果。 为了检查光对 4T1 细胞的影响，用 808 nm 激光 (0.6 W/cm2) 照射细胞 5 分钟。 如图所示，4T1 细胞活力几乎看不见的下降，表明 4T1 细胞对这些条件特别不敏感。 如图所示，Cy-D-5 和 ICG 在黑暗条件下没有表现出明显的毒性，表明两种染料在没有光照射的情况下具有生物相容性和安全性。 此外，Cy-D-5表现出更高的光细胞毒性。 对于 4T1 细胞，在 808 nm 激光 (0.6 W/cm2) 5 分钟后，计算出的 Cy-D-5 半最大抑制浓度 (IC50) 约为 4.08 µM。 这种有效的光细胞毒性可归因于 Cy-D-5 诱导的 1O2 生成和光热加热的综合效应。 然而，ICG在激光照射下没有表现出明显的细胞毒性，这是因为它很难进入细胞。 受观察到的 CyD-5 在 PDT 和 PTT 中的协同治疗作用的启发，我们进一步研究了 PDT 或 PTT 在体外对 Cy-D-5 的个体贡献。 随后，为了阐明 1O2 在 Cy-D-5 光细胞毒性中的作用，将 4T1 细胞与 ROS 清除剂叠氮化钠 (NaN3) 一起预孵育。 如图所示，与无NaN3的组相比，Cy-D-5+NaN3+Light组的PTT治疗效果不明显降低，这应该是由于PDT的抑制所致。 另一方面，为了进一步评估 Cy-D-5 的 PDT 作用，在光照期间使用冰袋以避免温度升高。 PDT组细胞抑制作用较PTT组明显减弱。 这一发现表明 PTT 也对 Cy-D-5 的细胞毒性有显着影响。 PDT 和 PTT 联合治疗的联合指数经计算为 0.63，表明两种方式之间存在协同相互作用。 这种协同作用比单独使用任何一种疗法更有效地增强肿瘤细胞生长抑制。活/死细胞染色测定还证实 PTT 和 PDT 在 Cy-D-5 诱导细胞死亡的光细胞毒性中发挥重要作用。活/死细胞染色结果表明Cy-D-5诱导的细胞死亡比例较高。
体内抗肿瘤作用
体外结果鼓励我们进一步探索 Cy-D-5 在体内肿瘤治疗中的效用。 选择4T1荷瘤Balb/c作为模型。 如图所示，肿瘤内的荧光强度随着时间的推移逐渐增加，在注射Cy-D-5后4小时左右达到最大值。 随着时间跨度的增加，荧光逐渐减弱，但24 h仍可观察到荧光信号。 因此，瘤内注射后4小时进行光照，以最大限度地发挥治疗效果。我们在 4T1 荷瘤小鼠模型中评估了 Cy-D-5 的光疗效果。 通过将4T1细胞皮下注射到小鼠右腋窝建立荷瘤小鼠模型。 一旦肿瘤达到约 100 mm3 的大小，将小鼠随机分为六组进行不同的处理：(1) PBS（仅用 100 µL PBS 处理，作为对照），(2) PBS + Light（用 100 µL PBS 处理） 然后用808 nm激光（0.6 W/cm2）照射10分钟），（3）ICG（用200 µM ICG处理 [100 µL]), (4) ICG + 光（用 200 µM ICG [100 µL] 处理，然后用 808 nm 激光 [0.6 W/cm2] 照射 10 分钟），(5) Cy-D-5（用 200 µM Cy-D-5 [100 µL]）和 (6) Cy-D-5 + 光（用 200 µM 处理） Cy-D-5 [100 µL]，然后用 808 nm 激光 [0.6 W/cm2] 照射 10 分钟）。 记录所有光照射组的4T1荷瘤小鼠以评估体内PTT性能。 如图所示，“Cy-D-5 + Light”组的温度迅速升高至53°C，明显超过“ICG + Light”组（最高温度约为47°C）。 此外，“PBS + 光”组的温度表现出最小的温度变化。 此外，每隔一天监测肿瘤体积和小鼠体重。 小鼠的肿瘤体积在不同组之间表现出显着变化。如图所示，PBS 处理的小鼠（黑暗和光照条件下）的肿瘤体积显示出显着的生长，表明单独的光照不会显着影响肿瘤进展。 Cy-D-5或ICG无光组也表现出与对照组相似的肿瘤生长，表明Cy-D-5和ICG没有明显的暗细胞毒性。 “ICG + Light”组和“Cy-D-5 + Light”组均表现出肿瘤体积缩小，并且仅通过一次治疗即可成功抑制肿瘤。 然而，与“ICG + Light”组相比，“Cy-D-5+Light”组表现出肿瘤完全根除且没有复发。“Cy-D-5 + Light”组的这一观察结果证实了 PTT 和 PDT 联合疗法的有效性。孤立肿瘤的代表性图像进一步证明了Cy-D-5在光照射下的显着抗肿瘤作用。
总结
我们根据 Cy5 单体提出了二聚化策略，以创建能够同时进行高质量近红外荧光成像、PDT 和 PTT 的新型光治疗剂。与单体相比，苯桥Cy5二聚体表现出更长的吸收波长，促进分子间π电子耦合，从而增强其光捕获能力。有趣的是，由于 J-聚集体的形成，二聚体的主吸收带在 PBS 中发生显着的红移。 二聚体的吸收峰位于810 nm，与ICG和单体Cy5相比，该吸收峰明显红移。事实上，CyD-5 表现出卓越的性能，包括 810 nm 的扩展吸收波长、EtOH 中 31.9 × 104 M−1 cm−1 的高 ε、优异的光稳定性、显着的 1O2 生成能力以及 64.4 的高 PCE %。 此外，Cy-D-5 在 4T1 细胞中表现出显着的光毒性，IC50 值为 4.08 µM。 体内研究进一步表明，CyD-5在808 nm激光照射下可以实现肿瘤的完全消融，而不会对正常器官造成明显损伤。
参考文献
Dimerized Pentamethine Cyanines for Synergistically Boosting Photodynamic/Photothermal Therapy,Haiqiao Huang,Qiang Liu,Jing-Hui Zhu, Yunkang Tong,Daipeng Huang,Danhong Zhou ,Saran Long ,Lei Wang ,Mingle Li ,Xiaoqiang Chen ,Xiaojun Peng,Aggregate, 2024; 0:e706,https://doi.org/10.1002/agt2.706
