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 内容提要

本文设计了一种具有可调亚细胞器（包括细胞膜、线粒体、脂滴、溶酶体和内质网）的近红外（NIR） I型聚集诱导发射（AIE）光敏性的分子框架，该分子框架可精确调节亚细胞位置的I型ROS。在660nm激光照射下，细胞膜靶向TCF-Mem能有效诱导癌细胞焦亡，在预防性肿瘤疫苗模型中充分增强体内抗肿瘤免疫。体内抗肿瘤I型PDT可以根除原发肿瘤，更重要的是通过体外作用抑制远处肿瘤的生长，从而获得特异性抗肿瘤免疫。

结果与讨论

本研究以2-二氰甲基-3-氰基-4,5,5三甲基-2,5-二氢呋喃（TCF）分子为核心受体单元(A)，含甲氧基的三苯胺（TPA）为强电子给体单元(D)，苯环作为桥接单元形成D-π-A型分子TCF- OH。该设计旨在通过采用具有高度扭曲结构的TPA单元来减轻聚集引起的猝灭（ACQ），从而减少分子间的堆叠。随后，不同的靶向单位被纳入苯桥的羟基，生成亚细胞器靶向分子（TCF-Mito, TCF-ER, TCF-LD， TCF-Lyso和TCF-Mem）。TCF-Mito、TCF-ER、TCF-LD、TCF-Lyso和TCF-Mem在PBS缓冲液中分别在≈550 nm和835 nm处表现出最大的吸收和发射峰，处于适合红光激发的NIR-I （700-900 nm）窗口内。此外，这些分子表现出AIE性质，特别是在纯DMSO中表现出弱荧光，随着溶剂混合物中PBS比例的增加，这种荧光增强。使用2,7二氯二氢荧光素（DCFH）评估I型或II型PDT过程中的总ROS产生，其中在660 nm激光（0.5 W/cm2）照射下，525 nm处的荧光强度随照射时间增加，TCF-Mem、TCFMito和TCF-LD的ROS生成能力强于商用II型光敏剂Ce6。采用单线态氧传感器绿色（SOSG）检测O₂，双氢马角胺123 （DHR123）检测O₂^−•，羟基荧光素（HPF）检测•OH，进一步确定了特定的ROS种类。这些指标的排放量随着照射时间的增加而增加，特别是O₂^−•和•OH，而Ce6在光照下只产生单线态氧，而不产生O₂^−•和•OH，表明这些亚细胞器靶向的近红外AIE光敏剂产生ROS的主要类型是I型光化学途径此外，使用5,5-二甲基-1-吡咯啉n -氧化物（DMPO）专门监测•OH的生成，在光照下TCF-Mem中显示出强烈的信号。

为了保证光敏剂作用于不同的细胞器，不同的基团修饰了光敏剂的羟基。采用亲水性季铵盐单元对细胞质膜（Mem）进行靶向处理。三苯基磷被用于靶向线粒体（Mito），已知线粒体在跨膜电位的驱动下通过穿过内膜而积聚在那里。溶酶体（Lyso）选择了烷基啉，由于其在生理ph下的质子化作用，氯丙基靶向内质网（ER），接枝两个苯基增强了亲脂性和体积，以靶向脂滴（LD）。为了评估光敏剂靶向细胞器的效果，我们将这些光敏剂与商业细胞器探针一起在HeLa、4T1和panc02细胞中培养。通过共聚焦激光显微镜观察发现，每种新的光敏剂在所有三种细胞系中都与相应的商业标记物有显著的共定位，Pearson相关值为0.79至0.96。

细胞膜靶向NIR I型AIE光敏剂TCF-Mem在诱导缺氧实体瘤中免疫原性细胞死亡方面具有独特的优势。如图所示TCF-Mem在细胞膜上表现出极好的靶向性，锚定时间极长，即使在120 min后也能在细胞膜上积累。随后，我们探索了TCF-Mem在4T1癌细胞中产生ROS的情况，并使用荧光探针2 ',7 ' -二乙酸二氯荧光素（DCFHDA）检测细胞内ROS。TCF-Mem在光照下显示出明显的绿色荧光信号，表明细胞中产生了大量的ROS。来自二氢乙二胺（DHE）和O₂−•的红色荧光和来自羟基荧光素（HPF）和•OH反应的绿色荧光证实了它们在细胞内产生I型ROS。此外，在厌氧条件下培养的细胞也显示出大量的I型ROS的产生。用单线态氧传感器绿色（SOSG）探针进行的类似实验没有发现产生¹O₂的证据。此外，我们还用calceinAM（活细胞染色）和碘化丙酯（PI，死细胞染色）联合染色来证明TCF-Mem对4T1癌细胞的杀伤作用。如图所示，PBS、PBS + Laser和TCF-Mem组只观察到绿色荧光信号，而TCF-Mem + Laser组细胞发出强烈的红色荧光，说明TCF-Mem + Laser对4T1癌细胞具有高效的PDT作用。此外，在黑暗条件下，4T1细胞在0-80 μM TCF-Mem溶液中的存活率超过90%，表明TCF-Mem在无光条件下对细胞的毒性较低。有趣的是，在660 nm激光照射5 min后，随着TCF-Mem浓度的增加，细胞存活率显著降低，表明TCF-Mem具有有效的抗肿瘤作用。

TCF-Mem在PDT期间引起了与焦亡一致的形态学变化，而相应的对照组未观察到明显的形态学变化。将TCF-Mem与4T1癌细胞一起培养30分钟，用660 nm激光照射5分钟，30分钟内实时观察4T1细胞的细胞膜逐渐膨胀并最终破裂，表明有明显的焦亡过程。在Panc02和Hela细胞中观察到类似的焦亡现象，表明TCF-Mem是一种广谱光敏剂，可诱导焦亡。Western blot分析显示，TCF-Mem + Laser组4T1癌细胞表达的GSDMD-N浓度显著升高。焦亡是DAMPs的一种有效形式。进一步观察TCF-Mem诱导4T1细胞中DAMPs的表达。如图所示，TCF-Mem + Laser治疗组释放细胞内CRT易位和“eat-me”信号，促进树突状细胞吞噬死亡的4T1细胞，上调抗肿瘤免疫。随后，我们进一步研究了其他细胞因子的释放水平，如HMGB1、LDH、IL-1时延、IL-18和ATP。结果显示，TCF-Mem + Laser处理后，4T1细胞核HMGB1水平明显降低，细胞上清液中ATP、LDH、IL-1、IL-18浓度显著升高。这些结果表明，TCF-Mem在激光照射后具有良好的免疫原性。

建立4T1肿瘤模型，评价tcf - mem介导的焦亡是否能有效诱导特异性全身抗肿瘤作用。治疗后每隔三天追踪右侧原发肿瘤和左侧远端肿瘤的扩张情况，以评估治疗效果。值得注意的是，在一周内，TCFMem联合激光治疗组的原发肿瘤的增殖开始减少，同时远端肿瘤的进展也得到了遏制。这表明TCF-Mem能够通过利用光介导的焦亡引发的全身免疫反应来抑制远处恶性肿瘤。通过组织学和免疫组化评价进一步证实了TCF-Mem的肿瘤抑制特性。

用苏木精和伊红（H&E）染色的肿瘤组织切片显示，在对照组细胞形态保持不变的情况下，TCFMem组的肿瘤组织在暴露于光下后表现出明显的损伤，这表明TCFMem具有精确的光动力治疗作用。此外，为了深入研究TCF-Memmediated pyroptosis诱导的光免疫疗法的免疫学基础，我们在治疗的第四天对原发和远端肿瘤进行了分析，重点关注树突状细胞的成熟和T细胞的活化。最初采用免疫荧光染色法检测TCF-Mem + Laser组原发肿瘤中CRT和HMGB1的表达。结果显示，HMGB-1在原发肿瘤细胞中从细胞核迁移，而CRT在细胞膜上明显聚集。这表明使用tcf - mem介导的焦亡在体内诱导免疫原性细胞死亡（ICD）的潜力。随后，利用流式细胞术测量肿瘤内的免疫细胞群，观察到TCF-Mem +激光治疗后树突状细胞上CD80和CD86生物标志物的表达增加，表明成熟树突状细胞丰富。同样处理后，CD8+ T细胞在原发肿瘤中的比例增加到18.6%，在远端肿瘤中的比例增加到13.3%。免疫荧光染色显示，与其他对照组相比，TCF-Mem + Laser组的原发和远端肿瘤中CD8+ T淋巴细胞计数升高，强调原位肿瘤治疗后全身免疫反应的激活。

总结

本研究通过对D-π-A分子进行修饰，合成了一系列ni -缓解型AIE光敏剂（TCF-Mito、TCF-ER、TCF-LD、TCF-Lyso和TCF-Mem）。I型光敏剂的一个关键设计要素是选择合适的电子给体、受体和电桥，使三态激子T1的能量低于促进三态氧向单态氧有效转化所必需的阈值。这些光敏剂表现出广泛的红外吸收和近红外发射范围，并且在660 nm激光激发下能够产生大量的I型ROS。其中，靶向细胞膜TCF-Mem是一种多功能诱导剂，通过I型ROS诱导癌细胞焦亡，释放丰富的抗原成分，在预防性肿瘤疫苗模型中可充分增强体内抗肿瘤免疫。此外，tcfmem诱导的焦亡可以消除原发肿瘤，防止免疫逃逸，从而促进全身抗肿瘤免疫，有效抑制远端肿瘤的生长。

参考文献

Precise Molecular Engineering of Multi-Suborganelle Targeted NIR TypeI AIE Photosensitizer and Design of Cell Membrane-Anchored Anti-Tumor Pyroptosis Vaccine,Chunbai Xiang, Yu Liu, Qihang Ding, Ting Jiang, Chao Li, Jingjing Xiang, Xing Yang, Ting Yang, Yue Wang, Yanfei Tan, Ling Mei, Zhiyun Lu,* Jong Seung Kim,* and Ping Gong*,Adv. Funct. Mater. 2024, 2417979,https://doi.org/10.1002/adfm.202417979