有机染料具有光稳定性和高亮度等优点，在活细胞成像中起着至关重要的作用。在此，我们介绍了一种超光稳定和明亮的有机染料，Phoenix Fluor 555 (PF555)，它在不需要任何抗光漂添加剂的情况下，比传统的有机染料具有更长的光漂寿命。PF555是一种不对称菁氨酸结构，在其一侧，常规菁氨酸-3中的吲哚被3-氧喹啉取代。在生理条件下，活细胞质膜上表皮生长因子受体与网格蛋白包被结构的动态单分子相互作用的成像证明了PF555为长期活细胞单分子成像提供了强大的工具。
光蓝TSCy5衍生PF555的表征
我们在COS7细胞中表达了在其氨基端偶联Halo标签的EGFR (Halo-EGFR)，并用氯烷偶联AF647 （CA(O2)-AF647）标记。然后，我们使用642 nm激光照射标记的细胞，直到AF647在远红色通道（654-870 nm）中完全光漂白，以产生由561 nm激光激发在红色通道（572-624 nm）中鉴定的光蓝物种衍生的新生荧光。出乎意料的是，在光蓝物种中，我们观察到一种超光稳定的物种在完全培养基（含10% FBS的无酚红DMEM）中表现出前所未有的长期单分子活细胞成像，而不需要任何添加剂来抑制光漂白。为了纯化这种超光稳定的物种并阐明其化学结构，我们首先合成了大量的TSCy5作为AF647的简化和类似的化合物。为了在体外对TSCy5进行体水平的光蓝，我们使用了高激光功率和恒定的氧气补充，因为反应过程快速消耗氧气。在高效液相色谱分析中，观察到两个候选峰（保留时间(tR) = 18.36 min和20.05 min）在550 nm处具有强吸光度。我们纯化了产生这两个峰的成分，并在bulk和单分子水平上证实，后一个峰(tR = 20.05 min；产率，0.007%)产生了超光稳定的物种，而另一个峰是由TSCy3产生的，这与之前报道的Cy5的光蓝产生Cy3一致。通过高分辨率质谱分析，确定了超光稳定产物的化学式为C30H36N2O13S4，与TSCy5 （C31H38N2O12S4）的化学式不同，它损失了一个CH2基团，加入了一个氧原。核磁共振波谱分析表明，超光稳定产物为不对称菁菁结构，其中一侧的吲哚被3-氧喹啉取代，与传统菁菁染料的吲哚有明显区别。这种结构是一类新的含酮菁菁，定义为3-氧菁菁染料。激发和发射峰值分别为555 nm和567 nm，除了在477 nm处增加了一个激发峰外，激发和发射曲线的形状与含有肩峰的常规Cy3相似。我们还测量了PF555的消光系数、量子产率和荧光寿命。PF555具有前所未有的高消光系数（1,940,000 M−1 cm−1）和低量子产率（0.013±0.0009）。我们将这种超光稳定染料命名为凤凰氟555 （PF555）。
功能化PF555与其他有机染料的比较
我们比较了CA(O4)-PF555与其他三种荧光光谱相似的常见有机染料CA- alexa Fluor 555 （CA- af555）、CA- jfx549和CA- tmr的光稳定性。我们使用这些氯烷偶联染料标记COS7细胞中表达的Halo-EGFR，然后在全内反射荧光（TIRF）显微镜下使用561 nm激光对标记的细胞进行连续成像，在整体水平上对所有染料使用相同的激光功率。PF555光漂白寿命为314.4 s，比AF555 （23.6 s）高13.3倍，比JFX549 （9.1 s）高34.5倍，比TMR （5.6 s）高56.1倍。由于延长了成像时间，我们能够确认CA(O4)-PF555没有引起明显的细胞毒性或光毒性。此外，我们还验证了CA(O4)-PF555与各种细胞蛋白的通用性，包括Halo-B2AR和Halo-FIS1。我们测定了CA(O4)-PF555在Halo-B2AR和Halo-FIS1中的光漂白寿命分别为313.0±25.1 s和299.9±29.7 s，这与EGFR中的光漂白寿命一致。我们还通过直接测量这些染料的单分子强度，对AF555、JFX549和TMR在不同的561 nm激光功率强度（100 ~ 32,000 mW cm−2）下的亮度进行了比较分析。有趣的是，PF555的亮度比AF555高4.2±0.4倍，比TMR高1.5±0.1倍，比JFX549低0.3±0.03倍。表明PF555适用于单分子成像应用。我们还证实，当CA- af555归一化后，玻璃上CA(O4)-PF555的单分子强度与细胞上标记的CA(O4)-PF555的单分子强度没有差异。此外，由于强亲水性，PF555和CA(O4)-PF555即使在高浓度（~1 μM）下也对细胞表面和玻璃表面具有较低的非特异性结合（Supplementary Fig. 29），这对活细胞单分子应用非常有利。由于PF555和CA(O4)-PF555在477 nm处有额外的激发峰，我们表征了PF555在488 nm处的发射特性，这是最接近的可用波长，因为典型的荧光显微镜缺乏477 nm通道。在488 nm激光激发下，我们观察到红色通道（572-624 nm）的荧光信号与561 nm激发产生的荧光信号相当（补充图30a）。此外，我们观察到CA(O4)-PF555在488 nm激发下具有超光稳定性，平均光漂白寿命为299.1 s（补充图30b），与561 nm激发时的寿命相似。
EGFR内化和再循环的长期活细胞成像
由于荧光团的光漂白，利用荧光成像进行长期可视化和定量一直是具有挑战性的。在这里，我们展示了PF555的超光稳定性优势，通过时间分辨率为500 ms的延时成像来可视化EGF诱导EGFR内吞的长期过程。我们在表达CA(O4)-PF555标记的Halo-EGFR的COS7细胞中添加EGF来诱导EGFR内化。在我们观察到EGFR完全内化后，我们清洗EGF以进一步研究内化的EGFR是如何回收的。egf诱导的一系列EGFR内化和再循环过程持续了约1小时，我们使用PF555直接观察了整个过程，没有明显的光漂白，而在这种成像条件下，常规AF555在几分钟内就进行了光漂白。我们定量测定了EGFR内化和再循环的速率，分别为2.8±0.7 min和9.1±2.5 min。EGFR内在化和再循环的量分别为91.7±3.0%和20.7±5.2%。
EGFR与网格蛋白包被结构相互作用的长时间高密度单分子成像
利用PF555优异的光稳定性和高亮度，我们进一步在没有任何常用的抑制光漂白的添加剂的生长条件下，在活COS7细胞中进行了EGFR的单分子成像。由于PF555会自发地从黑暗状态恢复到明亮状态，这使我们能够在1小时内保持低密度的单分子跟踪，并构建单个活细胞中EGFR单分子轨迹的高密度图。我们还证实，当我们将PF555的长轨迹切成短片段以匹配AF647的轨迹长度时，PF550标记的EGFR的短期分布与AF647标记的EGFR在同一单个细胞中的短期分布几乎相同，这表明PF555可以可靠地从传统的短期信息中扩展长期单分子信息。此外，与AF647相比，CA(O4)-PF555标记并未改变EGFR的化学计量组分。我们直接捕获了活COS7细胞中EGFR的长期单分子动力学。均方位移（MSD）分析解释了这些轨迹的短时间尺度，但在30-50秒的时间范围内开始失效，即使使用了足够的数据点，这表明由于与其他蛋白质和结构相关的分子和细胞过程的参与，各种EGFR转变发生在几十秒的时间尺度上。在单分子水平上使用隐马尔可夫模型的时间序列分析和角度位移图提供了在每个长轨迹的MSD分析中无法显示的额外时空信息（并且很难使用常规的短轨迹推断），例如扩散状态之间的多重转换，跳跃扩散，跨越大面积质膜的约束，在短时间尺度上无法与固定分子区分的缓慢移动状态，以及与EGFR相互作用的亚细胞结构的形状。
结论
PF555 在细胞培养基或水中展现出超光稳定性、高亮度以及光激活特性，且无需任何添加剂。这些特性在 AF555 中并未出现，AF555 是一种传统的 Cy3 结构，对称地含有带磺酸基团的吲哚环 ，这表明 PF555 的这些独特性质源自其不对称的花菁结构，在该结构中吲哚的一侧被 3 - 氧代喹啉所取代。我们使用不对称的 AF647 对 PF555 进行的液相色谱 - 质谱分析显示，除了单羧酸结构外，还存在一种额外的二羧酸，这只能是中间体相互作用的结果，表明形成了一种分子间产物。这一发现与之前报道的 Cy5 降解为 Cy3 遵循分子内途径的情况形成对比 。
尽管 PF555 最终纯化产物的平均产率约为 0.01%，但光蓝移是一种能快速获取适量（约 10 皮摩尔）产物以供细胞成像立即使用的方法。光蓝移是制备 PF555 的关键步骤，在体外，用任何市售的 642nm 远红光激光器或任何荧光显微镜的激光器照射样品，即可轻松实现。不过，还需要进一步研究来提高产率，包括基于反应机制优化反应途径，或开发一种新的 PF555 合成方法，以防止在光蓝移反应过程中发生光漂白。PF555 和 CA (O₄)-PF555 在核磁共振光谱和高分辨率质谱数据中均未显示出聚集倾向。我们发现，在活细胞中，CA (O₄)-AF647 和 CA (O₄)-PF555 的扩散率没有显著差异，这表明 CA (O₄)-PF555 不会在活 COS7 细胞质膜上聚集或诱导 Halo - EGFR 聚集。此外，我们观察到，当 CA (O₄)-PF555 标记到 Halo - EGFR 上时，不会诱导 EGFR 聚集，也不会干扰 EGF 诱导的 EGFR 内吞和回收功能，而当 EGFR 聚集时，该功能通常会受到干扰。
我们之前的研究表明，光蓝移现象是一种普遍现象 ，这意味着有可能在可见光谱范围内发现另一种超稳定物质。我们发现，Sulfo - Cy7 在 642nm 激光照射下，无论是在体相还是单分子水平，其光蓝移都会产生一种在远红光通道（654 - 870nm）具有卓越光稳定性的物质。这种光蓝移后的 Sulfo - Cy7 的光稳定部分是我们用于远红光通道的 Phoenix Fluor 染料的新光谱系列，它有两个激发峰，分别位于 580nm 和 610nm，发射峰位于 670nm（扩展数据图 10d）。有趣的是，这种光谱特性与 PF555 相似，PF555 也有两个激发峰，分别在 477nm 和 555nm，发射峰在 567nm。这种独特的光谱特征可能有利于依赖大斯托克斯位移的荧光成像应用，如荧光共振能量转移（FRET）或流式细胞术 。PF555 染料从暗态的自发恢复有利于对同一细胞进行长期重复成像。我们的研究结果表明，与单分子光漂白寿命相比，PF555 的自发恢复可能会显著延长其整体光漂白寿命。PF555 的光稳定性和自发恢复特性相结合，对于实现长期活细胞成像至关重要。
通过利用可光激活和 / 或可光切换的荧光团，包括 mEos 蛋白，或者是搭配有氧清除系统和伯硫醇的 AF647，亮态下标记分子的低密度得以维持，从而能够在同一活细胞中进行多轮单分子数据采集。收集到的大量单分子数据足以进行统计分析，进而推断各种扩散状态（包括自由态、受限态和固定态 ）之间的转变。然而，轨迹的持续时间不足以研究长期时间尺度上发生的分子过程。利用 PF555 的自发恢复特性获得的表皮生长因子受体（EGFR）轨迹高密度图，使得观察 EGFR 的扫描状态成为可能，而传统染料产生的短轨迹无法实现这一点。与传统的全内反射荧光显微镜相比，将 MINIFLUX 等高效光子技术与 PF555 相结合，能显著提高在更长时间内观察更快单分子动力学的能力。使用 PF555，可以在生理条件下直接观察单个活细胞中各种分子过程里单个蛋白质与其他细胞成分之间的动态相互作用。
参考文献
Super-photostable organic dye for long-term live-cell single-protein imaging,Do-Hyeon Kim ,Hong Minh Triet ,Sun Hyeok Lee5, Sina Jazani, Seongjae Jang,Syed Ali Abbas Abedi ,Xiaogang Liu,Jongcheol Seo ,Taekjip Ha ,Young-Tae Chang & Sung Ho Ryu ,Nat.Methods,https://doi.org/10.1038/s41592-024-02584-0
