内容提要
本文提出了一种吡啶转子策略来开发带正电荷的TBTP-Bz，该TBTP-Bz与STING激动剂MSA-2稳定地结合成热响应性外泌体-脂质体混合纳米颗粒，用于肿瘤靶向递送。TBTP-Bz具有聚集增强的NIR-II发射和光声信号，实现实时肿瘤跟踪。其光热刺激诱导免疫原性癌细胞死亡，促进MSA-2的精确释放，从而促进STING激活和STING介导的I型干扰素的产生。值得注意的是，单剂量光免疫治疗有效地抑制体外肿瘤生长，并激发免疫记忆效应来抑制术后复发和再挑战的肿瘤。力。
促进分子运动发展NIR-II发射AIE光热剂
设计了一系列具有D−π−A型结构的分子，其中甲氧基三苯胺和吡啶部分分别作为电子给体(D)和电子受体(A)。低带隙苯并[1,2-c:4,5c ']二唑（[1,2,5]噻二唑）受体和具有粗链烷基的π共轭噻吩环作为扩展的π桥和分子间间隔物战略性地结合在一起。该设计旨在加强D - A相互作用，促进分子内电荷转移，从而减小电子带隙，延长吸收和发射波长。此外，三苯胺的扭曲构象和掺入的烷基链有效地阻止了分子间π−π堆积，在聚集态下形成了明显的AIE效应和增强的荧光。在吡啶上加入一个苄基作为n取代基，增加了分子间空间，增强了分子内运动。从而合成了带正电荷的TBTP-Bz。合成TBTP和TBTP-COOH作为对照。所有分子的合成率都很高，从75%到86%不等，它们的结构通过核磁共振和高分辨率质谱进行了充分的表征。研究了TBTP、TBTP- bz和TBTP- cooh的光学性质。在聚集态下，分子的吸收光谱在805 ~ 835 nm处达到峰值。在900 ~ 950 nm范围内检测到光致发光（PL）信号，其中宽波段跨越NIR-II区域1000 ~ 1550 nm。具有NIR-I吸收和NIR-II荧光，这些分子被证明是具有高信噪比的深层组织成像的理想选择。验证了TBTP、TBTP- bz和TBTP- cooh在不同好/差溶剂混合物中的AIE特性。TBTP、TBTP- bz和TBTP- cooh在THF或DMF中表现出较弱的发射，但在90%或99%的不良溶剂条件下表现出增强的PL信号。
混合仿生脂质体系统的制备与表征
为了保证药物传递效率和治疗效果，需要具有平衡肿瘤靶向特异性、刺激反应功能和生物屏障穿透能力的纳米颗粒。本文采用外泌体-脂质体融合策略包封TBTP-Bz和MSA-2，获得AMFL。采用薄膜水化法制备了外泌体-脂质体杂化纳米颗粒（FL）。AMFL的吸收光谱和FTIR光谱显示出与TBTP-Bz和MSA-2对应的特征峰，证实了这两种分子的成功加载。Western blot （WB）分析显示AMFL和外泌体膜中存在CD9和CD63蛋白。由于CD9和CD63是在4T1细胞源性外泌体上发现的特征性表面蛋白，它们在AMFL中的表达表明外泌体膜组分的成功整合，赋予其肿瘤靶向能力。DLS测量表明，AMFL的大小和zeta电位与脂质体保持一致，确保了混合纳米颗粒的稳定性。AMFL的透射电子显微镜（TEM）成像显示直径约80 nm的球形囊泡。如图所示，DPPC和DPPC-外泌体融合纳米颗粒的差示扫描量热法（DSC）分析显示出明显的相变过程，相变温度相似，为~ 41°C，表明凝胶到流体的合作和可逆热响应转变。随后，我们评估了AMFL的光热性质及其药物控释能力。在808 nm激光照射下，AMFL纳米颗粒在TEM图像中显示出膨胀和解体的形态，这可能是由于脂质体成分在TBTP-Bz光热作用下的热响应性质。此外，在AMFL的光热作用下实现了MSA-2的高效释放。此外，共聚焦显微镜图像显示，与仅含有脂质体作为包裹材料的AML相比，AMFL被癌细胞内化的能力增强，强调了其效力和癌细胞穿透能力。
增强STING通路激活的体外抗癌能力
利用肿瘤靶向能力和光热反应性药物释放功能，评估其抗癌功效。首先，进行了初步研究，以确保TBTPBz的治疗潜力优于其他两种分子。将封装TBTP- bz的FL命名为AFL，将封装TBTP和TBTP- cooh的FL命名为AFLa和AFLc。细胞计数试剂盒-8（CCK8）细胞活力测定和热成像记录显示，TBTP-Bz对荷瘤小鼠具有最高的光毒性和体内光热效应。其次，评价AMFL的体外疗效。AFL和包裹ttp - bz和MSA-2的纯脂质体被指定为AML，作为对照组。CCK-8细胞活力测定表明，AMFL对4T1细胞的细胞毒性可以忽略不计，这与先前的发现一致，即MSA-2不会对癌细胞产生直接的细胞毒性作用。AML在激光照射下表现出中等的细胞毒性，即使在高浓度的TBTP-Bz和MSA-2下，细胞存活率也为44.1%±4.4%，可能是由于其癌细胞内化不足所致。在近红外激光照射下，AMFL和AFL通过杀死超过90%的4T1癌细胞，表现出显著增强的细胞毒性，显示出TBTP-Bz的光热特性和FL包封的高效细胞递送。随后，流式细胞术通过annexin V-FITC/PI染色评估细胞凋亡率。激光照射后，amfl处理组的凋亡细胞比例激增至36.1%，超过对照组，预示着促凋亡过程的开始。为了阐明amfl介导的卓越抗肿瘤疗效背后的机制，我们研究了ptt诱导的ICD、DC成熟和相关免疫标志物。首先检测了ICD的典型特征，如三磷酸腺苷（ATP）释放、钙网蛋白（CRT）向细胞表面的易位以及高迁移率组框1蛋白（HMGB1）的表达。这些特征促进dc对抗原的摄取、加工和递呈，促进细胞毒性T细胞的产生。免疫荧光染色图像显示，近红外激光照射下，AFL和amfl处理组均检测到HMGB1和CRT的强烈荧光信号。与pbs处理的对照组相比，AMFL + NIR组肿瘤中的ATP水平增加了5.7倍，表明ICD诱导。在验证AMFL的icd唤起能力后，研究DC成熟度我们对不同组的4T1乳腺癌细胞进行处理，然后通过Transwell系统将混合纳米颗粒转移到BMDC中，与小鼠骨髓来源的树突状细胞（BMDC）间接共培养。AFL +NIR组和AMFL+NIR组的成熟dc种群分别增加36.1%和56.0%。相比之下，在没有激光照射的情况下，AMFL组的成熟DC种群没有明显变化（17.7%），这表明AMFL在没有有效药物释放的情况下对诱导DC成熟的影响有限。虽然ICD诱导已被报道为一种潜在的有前途的免疫治疗途径，但免疫逃逸对其有效性提出了挑战。为了解决这个问题，AMFL中的MSA-2作为sting通路激活剂来增强抗肿瘤免疫反应。为了进一步探讨AMFL是否可以激活癌细胞中的STING通路，我们分析了相关的信号通路。WB分析证实，与缺乏MSA-2的对照组（AFL + NIR组）相比，AMFL和AMFL + NIR组中磷酸化的STING、tank结合激酶1 （TBK1）和干扰素调节因子3水平升高，表明STING通路激活。值得注意的是，树突状细胞的STING通路受到刺激。低速离心后提取经amfl处理的4T1肿瘤细胞上清，用于BMDC调理。WB结果显示，AMFL处理后，关键STING信号成分的表达水平明显高于其他组。另一方面，证实了AMFL的高效DC摄取，提供了MSA-2可以传递到DC以激活STING的支持。此外，AMFL+NIR组的STING信号成分促进了4T1细胞和dc中IFN-β和TNF-α的产生，同时促炎细胞因子IFN-γ和IL-6水平升高。这强调了AMFL双重刺激ICD和STING通路的能力，从而增强DC成熟及其抗原呈递能力。
多模态成像实时体内肿瘤诊断
首先，对AMFL溶液进行成像，在808 nm激光激发下显示与浓度相关的NIR-II信号。然后静脉给药于荷瘤小鼠，通过NIR-II FLI监测肿瘤积累。作为对照，使用纯脂质体作为包封材料的AML也在相同条件下注射。在不同时间点用1250 nm旁路成像肿瘤结构。如图所示，AMFL组NIR-II荧光强度逐渐增加，肿瘤特征清晰。注射后12 h强度达到平台，即使在注射后24 h仍保持稳定，表明其长期保留潜力，较长的成像波长通过显著提高信噪比增强了肿瘤区域精细结构的空间分辨率。相比之下，AML小鼠在肿瘤区域显示出更弱的NIR-II荧光信号，表明AMFL有效的肿瘤积累。此外，体内生物分布也显示了类似的结果，AMFL具有更高的肿瘤积聚和保留。42此外，我们将AMFL静脉注射到小鼠血液中，并记录其血管造影。小鼠俯卧位的整个血管网络清晰可见，为早期疾病提供更准确的诊断信息。接下来，研究AMFL的体内PTT电位。静脉注射AMFL 12 h后，在808 nm激光照射下，用红外热像仪监测小鼠肿瘤温度随时间的变化。如图显示，在0.5 W/cm2照射5min后，amfl处理的小鼠温度明显升高，最高温度为50.6℃，而PBS处理的小鼠在相同条件下温度升高可以忽略不计。受光热效应的启发，研究了AMFL在PA成像中的应用。观察到的PA强度与AMFL浓度之间的直接相关性强调了促进PA定量成像的巨大潜力。通过静脉注射AMFL对4T1荷瘤小鼠进行体内PA肿瘤显像。图中为肿瘤在不同时间点的PA图像。注射后4小时肿瘤部位明显可见强烈的PA信号，注射后12小时左右达到峰值，与NIR-II成像结果一致。
TNBC的体内抑制、体外肿瘤抑制及术后复发和再挑战肿瘤的控制
我们进一步使用双侧肿瘤小鼠模型来研究AMFL作为光热免疫治疗触发器的体内治疗潜力。第0天将4T1细胞分别作为原发肿瘤和远端肿瘤注射至右侧和左侧，建立双侧肿瘤模型。当原发肿瘤达到~ 200 mm3时，将小鼠随机分为五组：PBS + NIR， FL（未负载的外泌体-脂质体杂交纳米颗粒），AML + NIR, AFL + NIR， AMFL和AMFL + NIR。经静脉注射，注射后12 h直接照射原发肿瘤（808 nm, 0.5 W/cm2, 5 min）。肿瘤评价结果表明，AMFL+NIR治疗对原发肿瘤具有有效的抑制作用，对远端肿瘤具有生长控制作用，生存率最高。给药后各组小鼠体重无明显变化。苏木精和伊红染色的肿瘤切片组织学检查显示，在原发和远处肿瘤中，AMFL都能有效地破坏肿瘤细胞，表明AMFL具有体外作用。
总结
我们构建了一种热敏性的靶向癌症的 AMFL，方法是用 4T1 三阴性乳腺癌（TNBC）细胞外泌体膜包裹，以及用包封了 TBTP-Bz 和 MSA-2 的温度响应性脂质体二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC）进行包覆。AMFL 配备了针对 4T1 肿瘤的特异性受体，静脉注射后，AMFL 通过长时间保留的 NIR-II 荧光发射和光热能量产生的光声（PA）信号对肿瘤区域进行成像。在 808 纳米激光照射下，TBTP-Bz 产生的杀肿瘤光热效应会使温度升高，这有助于 AMFL 的变形和药物原位释放，大大提高了 MSA-2 的递送效率及其对癌细胞和树突状细胞（DCs）的刺激干扰素基因刺激蛋白（STING）的活性，从而触发免疫反应，将免疫原性 “冷” 肿瘤转变为更敏感的 “热” 肿瘤。通过肿瘤的显著消退、对远处肿瘤的有效抑制以及对术后肿瘤复发和再次攻击的明显抑制，验证了光热免疫协同治疗效果。总之，这种热响应性仿生纳米药物通过实时 NIR-II 成像模式实现了精确的光热治疗（PTT），并通过激活 STING 通路增强了抗肿瘤免疫反应，可用于治疗免疫原性较差的肿瘤。
参考文献
Pyridinium Rotor Strategy toward a Robust Photothermal Agent for STING Activation and Multimodal Image-Guided Immunotherapy for Triple-Negative Breast Cancer,Shipeng Ning*, Ping Shangguan,Xinyan Zhu,Xinwen Ou,Kaiyuan Wang,* Meng Suo, Hanchen Shen, Xiuxin Lu, Xianqing Wei, Tianfu Zhang,* Xiaoyuan Chen,* and Ben Zhong Tang,J. Am. Chem. Soc. ,https://doi.org/10.1021/jacs.4c15534
