内容提要
为了实现近红外IIb窗口（NIR-IIb,1500 - 1700 nm）这一目标，我们开发了一种新型的基于经典的花青素染料的小分子染料(DA-5)，。通过将过量的多甲基还原为单个甲基，并破坏对称形成不对称的给体-π-受体（D-π-A）结构，增强了给体的电子给体能力，在1088 nm处产生发射。DA-5具有优异的化学和光稳定性，抗溶剂变色引起的猝灭，在水溶液中具有抗聚集性。DA-5具有大Stokes位移（241 nm）和高亮度（321 M−1 cm−1），可在NIR-IIb中实现淋巴系统、肠道血管、全身血管成像以及脑和后肢微血管的高性能成像。
分子设计
我们将菁氨酸分子重组为不对称的D-π-A结构，从而允许更有效地增强给电子部分。给体基团的修饰在调整NIR-II荧光染料的光物理性质，特别是其吸收和发射波长方面起着关键作用更大和更大的给电子基团增强了共轭作用，稳定了激发态，导致了显著的红移。像Flav7和BTC1070这样的分子表明，供体基团，如二甲胺或烷基胺，有效地将发射延伸到NIR-II区域。升级供体官能团（例如，羟基/甲氧基为强烷基胺）和通过用萘基取代苯基来扩展偶联也会导致红移。因此，图中示出了5种供电子能力逐渐增强的对取代芳醛，并选择它们来构建新的NIR-II染料。受体的选择受到需要平衡1000 nm以上的发射而稳定分子的限制。为了获得稳定的抗猝灭小分子，将多甲基链缩短为单个甲基，牺牲了约300 nm的发射最大值。这种发射损失可能不能完全由供体增强来补偿，因此必须有一个强的受体。选择菁染料HC1376是由于其特殊的吸电子能力和实现长波长发射的能力，使其成为这种设计的理想选择。
光物理性质评估
我们设计并合成了一系列以单共轭双键桥接供体和受体的不对称菁染料。通过各种醛衍生物与Fischer碱（α-硫代青花氨酸）在无水乙醇中发生Knoevenagel缩合反应，以高收率表面合成了DAs。首先，我们测量了这些染料在二氯甲烷中的光物理性质。将给体偶联从苯基延伸到萘基，将杂原子从氧变为氮，形成一个融合树六元环体系，可以使这些DA染料发生色移。给体工程策略提供了约400 nm的发射红移（从694到1088 nm），将含juloliddine的给体5定位为未来NIR-II分子开发的有前途的电子给体。探针DA-5在847/1088 nm处显示出最长的吸收/发射，证实了它是一种简单的真正的NIR-II染料。我们以IR26 （QY = 0.05%）为参考，测量了DA1−5在二氯甲烷中的量子产率（QYs）。具有NIR-II发射的DA-5具有0.77%的高QY，略低于我们实验室测定的众所周知的明亮染料Flav7的0.84%的QY，因此DA-5是进一步评价和体内应用的有力候选者。为了进一步筛选探针，我们直接比较了这些染料（10 μM）在InGaAs相机下与900至1500 nm的顺序长通（LP）滤波器的光致发光。DA-3在1200 nm以下的波长处亮度最高，而DA-5在1300 nm以上的波长处亮度最高。结果表明，DA-5非常适合长波成像，具有较大的穿透深度和较好的成像质量。
我们选择了经典的菁染料IR26和Flav7与新的探针DA5进行平行比较。IR26和Flav7的吸收光谱在极性溶剂如乙腈、二甲基亚砜和水溶液中显著降低和变宽。即使在胶束保护下，它们在水溶液中也几乎完全淬灭。相反，DA-5在极性环境中表现出波长（65 nm）的蓝移，强度下降33.7%，优于先前报道的具有相似发射波长的抗猝灭分子BTC-1080（下降60%），随着水分数的提高，IR26和Flav7自发地在超过200 nm的蓝移位置形成不需要的聚集体。它们几乎完全转化为75%含水量的聚集体。相反，DA-5表现出稳定的单吸收峰，在75%含水量时，其强度仅下降10%，未观察到聚集现象。随后，我们测试了这些染料对活性氧和生物亲核试剂的化学稳定性。DA-5本身保持得很好。DA-5表现出比Flav7更好的光稳定性，而IR26和ICG在连续短期（~ 5分钟）或长期（~ 60分钟）照射后失去了大量荧光。结果表明，DA-5具有良好的化学稳定性和光稳定性，在水溶液中不聚集，能有效抵抗溶剂致猝灭。
淋巴系统和肠道血管成像
优异的穿透深度和超过1500 nm的SBR值使得DA-5在NIR-I， NIR-IIa和NIR-IIb窗口中具有很高的体内生物成像潜力。DA-5被装载在胶束上进行体内生物成像。探针被皮下注射到小鼠尾巴底部附近，以跟踪淋巴系统，并使用顺序LP滤波器（900 ~ 1500 nm）在不同成像波长下评估体内成像质量。波长越长，淋巴系统的图像越清晰，这一发现也得到了更清晰的血管横截面定量数据的支持。为了进一步探索长波长窗口成像的优势，我们比较了900、1100、1300和1500 nm LP滤波器对肠系膜血管和肠壁血管成像的不同成像窗口。在长波范围内清晰地突出了密集排列的肠系膜血管以及较小的高阶肠壁血管；然而，在较短的波长（900和1100nm）下，由于较高的背景干扰，图像质量更加模糊。如放大后的白色虚线区域，在NIR-IIb处，肠壁的三条血管非常清晰，但在900 nm和1100 nm处，很难区分，几乎与背景信号混在一起。对蓝色横线框内肠系膜血管荧光信号的定量分析显示，在900 nm处分辨率分别为708 μm （SBR = 1.45）和597 μm (SBR = 1.40)，在1100 nm处分辨率分别为648 μm （SBR = 1.77）和513 μm (SBR = 1.84)，在1300 nm处分辨率分别为557 μm （SBR = 3.33）和548 μm (SBR = 3.60)，在1500 nm处分辨率分别为520 μm （SBR = 5.74）和405 μm (SBR = 6.07)。结果主要表明波长与背景干扰呈负相关，波长越长，背景干扰越弱。
全身血管造影成像
传统的NIR-I和NIR-IIa成像（900和1100 nm）相比，NIR-IIb成像具有更高的分辨率和清晰度，具有几乎透明的背景。虽然NIR-IIb区域的成像质量更高，但我们观察到的信号较弱，这是由于分子在较长波长的亮度降低。未来的工作将集中在增强分子的NIR-IIb亮度以提高信号强度。值得注意的是，与短成像窗口相比，1500 nm LP成像的同一血管的视宽度显示出更尖锐的峰值和更高的SBR值，表明NIR-IIb荧光成像提高了空间分辨率。动态生物成像能够实时捕获和分析生物过程。在这项研究中，我们记录了探针注射后小鼠腹侧位置的血流量。在NIR-IIb窗口中可以观察到明显的血管解剖，背景干扰可以忽略不计。相比之下，在传统的NIRIIa区域（1300 nm LP滤波器）中发现了模糊血管。特别是在肝脏区域，由于肝脏信号的强烈干扰，使用1300 nm LP滤波器难以识别血管。体外生物分布数据表明，DA-5主要积聚在肝脏，其次是胰腺、脾脏、肺和肾脏，在脑和肌肉等其他组织中积累最少。荧光强度在1至3小时之间的变化表明，随着时间的推移，该物质发生了动态再分布和部分清除。
在本研究中，我们选择了菁菁染料作为分子骨架，并大大缩短了其共轭结构（聚甲基长度），使分子具有优异的抗猝灭和抗聚集性能。我们通过打破花青素分子的对称结构，形成D-π-A结构，从而通过供体-规划策略促进了供体中给电子能力的增强，成功地将DA-5的分子波长推到了1100 nm左右。些抗猝灭和供体规划策略可以进一步扩展到其他菁染料，为建立明亮稳定的长波荧光团库铺平道路。令人印象深刻的是，在这样一个不对称的菁氨酸体系中，新的NIR-II分子的设计变得清晰和高度可行。通过选择高质量的电子给体和受体并任意组合，可以获得新的NIR-II染料。与BBTD和对称菁氨酸等传统支架相比，这些分子的化学合成非常简单，化学效率很高。DA-5具有稳定的化学和光学性质，高亮度，在水溶液中的抗猝灭特性，使其尾峰具有在NIR-IIb区域的体内成像能力。此外，DA-5的不对称结构具有241 nm的大Stokes位移，可以通过防止激发光谱和发射光谱之间的明显串扰来提高SBR，这是大多数花青素染料的障碍。
参考文献
Less Is More: Donor Engineering of a Stable Molecular Dye for Bioimaging in the NIR-IIb Window,Tianbao Wang,Yufei Qin,Jin-yu Wang, Yihan Xu, Jiaming Guo, Yiling Zhu, Huiyan Zhang, Yujie Qin, Zhong-Quan Qi, Hualong Fu, Ya-jun Liu, Mengchao Cui, and Kaixiang Zhou,J. Med. Chem. 2025, 68, 3782−3794,https://doi.org/10.1021/acs.jmedchem.4c02866
