内容提要
本研究选择光敏剂罗丹明衍生物作为捕光染料，富电子取代基n-亚硝基氨基酚作为一氧化氮（NO）释放成分，开发了一种多功能（深）红光活化NO光笼/光动力前药，用于有效治疗伤口和糖尿病足部感染。前体药物RhB-NO-2在一个小有机分子内集成了抗菌光动力治疗（aPDT）、NO灭菌和NO介导的抗炎特性，当暴露于（深）红色激光（660 nm）时能够释放NO并产生活性氧（ROS）。这种策略克服了使用单一光敏剂的局限性，这种光敏剂通常不足以消除耐药细菌。前药释放的NO可以与PDT产生的超氧阴离子（O2•−）相互作用，形成更具活性和氧化性的过氧亚硝酸盐（ONOO−）。这三种成分协同作用，增强抗菌效果。释放的NO可通过调节toll样受体2（TRL2）和肿瘤坏死因子-ɑ（TNF-ɑ）的表达抑制NF-kB通路，从而减轻组织炎症。
RhB-NO-2的合成
3-羟基-N, N-二乙基苯胺和邻苯二酸酐首先进行氟化反应，然后与环己酮环化得到不对称罗丹明类似物母核RN；然后与芳香醛反应得到中间体，经酯化氧化得到中间体RhB-CHO-2。然后通过醛缩胺缩合和硼氢化乙酸钠还原得到光笼中间体RhB-NH-2，并通过亚硝化反应得到目标化合物RhB-NO-2。
RhB-NO-2体外光控释放NO的研究
首先利用荧光检测，电子顺磁共振（EPR）和电化学方法验证RhB-NO-2的NO释放。由于NO在酸性环境下极易形成NO2 -，因此NO探针DAN与NO2 -在酸性环境下反应，产生具有可见荧光的萘酚三唑。在（深）红色激光照射下，405 nm处独特的荧光发射峰随着照射时间的增加而增加。此外，EPR光谱结果显示，RhB-NO-2在激光照射下成功释放NO，在没有激光照射的情况下，RhB-NO-2表现出背景信号，表明NO没有过早泄漏。电化学方法的结果也与EPR谱结果一致。
RhB-NO-2的PDT效应
利用二氢膦胺123 （DHR123）和电子自旋共振（EPR）检测了RhB-NO-2对O2•−的形成。结果显示，RhB-CHO-2和RhB-NO-2增加了DHR123的荧光强度，并且DHR123在激光照射下呈现出背景信号。此外，EPR光谱证实RhB-NO-2可以利用5,5-二甲基-1-吡咯烷n -氧化物（DMPO）作为O2•−陷阱产生O2•−。以9,10蒽二基-双（亚甲基）二丙二酸（ABDA）为特异的1O2指示剂，进一步评价RhB-NO-2生成1O2的能力。RhB-NO-2处理后的ABDA在激光照射下的吸光度（380 nm处）下降，而单独激光照射ABDA的典型紫外吸收峰没有明显改变。EPR光谱验证了以TMP为捕集剂的RhB-NO2生成1O2。
RhB-NO-2体外抗菌活性研究
基于RhB-NO-2良好的光响应性ROS/NO/ONOO−产生活性，初步采用浊度法评估RhB-NO-2对MRSA的体外抗菌效果。结果表明，激光照射下不同浓度RhB-NO-2处理的MRSA在600 nm处表现出显著的剂量依赖性，且RhB-NO-2的抗菌作用随浓度的增加而逐渐增强。。采用平板计数法定量评价RhB-NO-2对MRSA和PA的杀菌能力。结果显示，与其他组相比，MRSA或PA在激光条件下处理RhB-NO-2表现出明显的菌落生长抑制，这归因于PDT或NO治疗。值得注意的是，RhB-NO-2的治疗效果明显优于左氧氟沙星。说明PDT与NO联合使用具有协同杀菌作用。CCK-8细菌活力测定试剂盒进一步验证了RhB-NO-2的抑菌活性，结果表明RhB-NO-2的抑菌活性也随着浓度的增加而增强。此外，采用活/死染色法测定RhB-NO-2的抗菌活性。MRSA与RhB-NO-2孵育30 min后，激光照射，实验组大部分细菌被红色荧光染色。相比之下，其他组均可见绿色荧光。说明RhB-NO-2具有优良的杀菌性能。
除了生理环境中RhB-NO-2的ROS生成和NO释放测量外，我们还探索了细菌中RhB-NO-2的ROS生成和NO释放。由于RhB-NO-2在激光照射下能够同时生成O2•−和NO，我们假设O2•−可以与NO反应生成ONOO−，因此我们进一步研究了它们在细菌水平上的ONOO−生成。通过对革兰氏阳性菌耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）和革兰氏阴性菌铜绿假单胞菌（PA）的原位成像，我们使用荧光探针DCFH-DA监测ROS， DAF-FM DA监测NO和BBoxiProbe O56监测ONOO -，测量了ROS， NO和ONOO -的产生。与其他组相比，MRSA和PA在RhB-NO-2的660 nm照射下，三种商业探针检测到的MRSA和PA均显示出明显的绿色荧光。这些结果证实了RhB-NO-2在ONOO−、ROS和NO释放中的作用。
RhB-NO-2的体内抗菌活性
采用抗生素Lev和RhB-NO-2评价mrsa感染小鼠伤口的愈合活性。小鼠随机分为3组：1)磷酸盐缓冲溶液(PBS) +激光，2)RhBNO-2, 3) RhB-NO-2 +激光。通过测量初始创面的可修复面积来评估创面愈合情况。术后第0天各创面均出现严重炎症和溃疡，且RhB-NO-2联合激光照射组创面愈合率明显高于抗生素组和RhB-NO-2未联合激光照射组。提示激光条件下RhB-NO-2产生的NO和ROS在创面愈合中具有协同治疗作用。对不同处理组小鼠伤口的半定量分析显示，在治疗后第10天，RhB-NO-2 +激光照射组的伤口面积减少到原来的2.93%，表明RhB-NO-2 +激光照射组的伤口面积几乎完全愈合。结果表明，激光照射下RhB-NO-2产生的ROS和NO具有协同促进皮肤创面愈合的作用。经PDT和NO协同治疗后，健康大鼠的白细胞（WBC）、淋巴细胞（LY）和中性粒细胞（NEUT）计数降至正常水平。此外，在给药后第10天，给药组血常规检查结果与空白对照组相似，说明前药RhB-NO-2具有良好的生物安全性。采用苏木精和伊红染色标本（H&E）和Masson染色进一步评价RhB-NO-2对创面愈合的影响。治疗10天后，RhBNO-2 +激光照射组表皮和角质层再生明显，角质层几乎完全覆盖新形成的表皮层，表皮出现乳头状层，说明表皮结构完整，皮肤连接清晰。而其他对照组仍有明显的表皮和真皮组织分离。Masson染色分析显示，RhB-NO-2 +激光照射组在第10天出现结构致密的胶原原纤维（蓝色染色），真皮胶原沉积量最高。相比之下，对照组的胶原纤维出现了更多的红色染色，说明对照组的部分胶原纤维仍在降解。这些结果表明，RhB-NO-2 +激光照射组伤口愈合效果优于对照组，激光条件下RhB-NO-2产生的ROS和NO可用于抗菌活性和皮肤组织重塑和再生。
我们开发了光笼/光动力前药RhB-NO-2，将NO和ROS结合用于DFU和浅表伤口的治疗。前药由两部分组成：NO光控片段n -亚硝基氨基苯酚和光敏片段罗丹明类似物。在激光照射下，前药可以同时释放NO和ROS，从而结合PDT和NO治疗。此外，NO与O2•−反应生成毒性更大的ONOO−，从而产生更有效的协同抗菌效果和对耐药细菌感染的精确治疗。此外，RhB-NO-2在细胞和动物生物安全性评估中均表现出良好的生物相容性。该研究强调了PDT与NO治疗协同整合的潜力，并表明（深）红光激活的NO光笼/光动力前药可以进一步开发用于深部组织感染的精确治疗。
参考文献
Deep Red-Light-Mediated Nitric Oxide and Photodynamic Synergistic Antibacterial Therapy for the Treatment of Drug-Resistant Bacterial Infections,Jingjing Lin, Mingyi Cao, Shiya Wang, Xinyu Wu, Yuhan Pan, Zhiyue Dai, Ningge Xu, Lumin Zuo, Ji Liu,* Yuxin Wang, Qifeng Zhong, Yue Xu, Jianbing Wu, Lijuan Gui, Xueying Ji,* Heng Liu,* and Zhenwei Yuan*,Small 2025, 2408759,https://doi.org/10.1002/smll.202408759
