内容提要
本研究这项工作研究了两种光敏剂，与闭壳层的 2AM-CS 相比，具有扩展π共轭结构的4AM-OS呈现出开壳层自由基的特征，并且其 I 型光动力活性有所增强。4AM-OS 表现出热可及的三重态特征，这使得在较高温度下，更多的未成对电子能够沿着π共轭主链离域。4AM-OS 的光动力活性随温度变化的特性证实了它与开壳层电子结构之间的关联。由于开壳层的 4AM-OS 中的未成对电子离域程度更高，并且产生了额外的电子能态，光诱导的电荷转移得以促进，从而有利于 I 型光动力反应。这一观察结果解决了与近红外（NIR）光敏剂（如 4AM-OS）相关的挑战。
结果与讨论
合成了两种光敏剂（PS）。光敏剂 2AM-CS 由基于喹喔啉的八环稠合 D 核和 1,1 - 二氰基亚甲基 - 3 - 茚满酮 A 端组成，而 4AM-OS 是 2AM-CS 的二聚体，具有高度稠合的 π共轭结构，两个 2AM-CS 单元共享同一个吡嗪桥。此外，这两种分子在 A 端都被溴原子取代，以增强分子内电荷转移效应。使用两亲性载体 DSPE-PEG5000，通过纳米沉淀法制备了具有水分散性的 2AM-CS 和 4AM-OS 纳米颗粒（NPs）。透射电子显微镜（TEM）和动态光散射（DLS）分析表明，2AM-CS 和 4AM-OS 纳米颗粒呈现出均匀的球形形态，粒径分别为 56 纳米和 87 纳米。2AM-CS 纳米颗粒（NPs）和 4AM-OS 纳米颗粒的吸收光谱在 793 纳米和 795 纳米处呈现出相似的吸收最大值。此外，在 808 纳米光照射下，这些纳米颗粒展现出明亮的近红外二区（NIR-II）发射，延伸至 1400 纳米。随后，我们研究了这两种材料敏化光动力反应的能力。首先，使用自旋捕获剂 2,2,6,6 - 四甲基哌啶（TEMP）和 5,5 - 二甲基 - 1 - 吡咯啉 - N - 氧化物（DMPO），通过电子自旋共振（ESR）光谱对这两种材料在 808 纳米激光照射下产生的活性氧（ROS）物种进行了表征，在激光照射下，4AM-OS 和 2AM-CS 纳米颗粒均观察到了 TEMP / 单线态氧（1O2）加合物典型的 1:1:1 三重峰信号，这表明这两种材料都能发生 II 型光动力反应。对于由电子转移引发的 I 型光动力疗法（PDT），只有在激光照射下的 4AM-OS 显示出 DMPO / 羟基自由基（・OH）加合物的特征性 1:2:2:1 的 ESR 信号，以及 DMPO / 超氧阴离子自由基（O2・−）的超精细分裂。当使用 1,3 - 二苯基异苯并呋喃（DPBF）探测它们产生的总活性氧（ROS）时，结果表明 4AM-OS 是一种比 2AM-CS 以及市售的光敏剂二氢卟酚 e6（Ce6，通过 660 纳米激光激发）更有效的光敏剂。
我们使用细胞计数试剂盒-8 （CCK-8）对4T1肿瘤细胞进行了PDT体外细胞毒性评估。在808 nm激光照射下，4AM-OS和2AM-CS均表现出明显的光细胞毒性。在常氧和缺氧条件下，4AMOS NPs的半最大抑制浓度（IC50）值分别为6.1和9.9 μgmL-1。相应的，2AM-CS在常氧和缺氧条件下的IC50值分别为33.2和51.2 μgmL-1。此外，两种NPs在两种条件下均表现出最小的暗细胞毒性，最高可达50 μgmL-1。calcein-AM/PI染色的活细胞/死细胞分析进一步证实了4AM-OS NPs具有较高的光细胞毒性。此外，细胞透性荧光探针表明，在常氧和缺氧条件下，4AM-OS NPs均通过i型光动力反应产生O2・和・ OH。相反，只有在常压条件下才产生1O2。
我们进一步研究了4AM-OS的具体自由基性质。首先，可变温度电子自旋共振（VT-ESR）测量表明，4AM-OS在低温（110K）下仍然显示可见的ESR信号。随着温度的升高，自旋信号的强度显著增加，这表明了基态的开壳态单重态双基以及热可达三重态（Tt）的特征。此外，我们在不同温度下测试了4AM-OS的1h NMR光谱。由于其有限的溶解度和强的π-π相互作用，4AM-OS在室温下在芳香区显示出宽的共振峰。通常情况下，由于分子间的相互作用将被破坏，这些峰在更高的温度下会变得更清晰、更清晰。然而，在313K和373K之间，我们观察到4AM-OS的芳基质子的共振变宽。这可能是由于随着温度的升高，二自由基Tt态的增加。这种与自由基相关的效应导致电子解配对和离域，进一步拓宽了核磁共振信号，超过了温度依赖性溶解度的影响。
采用NAD+/NADH测定试剂盒，以2AM-CS NPs为对照组，研究4T1细胞与4AM-OS光催化反应对细胞内NADH的消耗情况。图中显示，在激光照射下，4AM-OS NPs处理后细胞内NADH水平显著下降。相比之下，在相同条件下，2AM-CS NPs处理的NADH耗竭可以忽略不计。对于所有组来说，NADH水平在黑暗条件下并没有受到影响。此外，对两种材料光氧化后细胞内NADH的表达量进行了量化，证实了开壳的4AM-OS NPs可以更有效地抑制细胞内NADH水平，而在相同浓度下，2AM-CS NPs对细胞内NADH水平的影响可以忽略不计。western blot （WB）检测4AM-OS光催化反应诱导细胞凋亡的途径。分析激光照射（808 nm, 0.3 Wcm-2）下4AM-OS处理的细胞中Bcl-2、Bax（促凋亡蛋白）和cleaved caspase-3（线粒体凋亡蛋白）的表达情况观察到Bax和cleaved caspase-3的表达增加，Bcl-2的表达显著降低。我们可以得出结论，一方面，光激发4AM-OS抑制NADH（抗氧化剂）表达，促进ROS产生，会打破细胞内氧化还原稳态平衡，导致cleaved caspase- 3的表达上调另一方面，NADH的破坏有效触发凋亡信号通路，导致抗凋亡Bcl-2蛋白表达下调，促凋亡蛋白如Bax.表达上调相比之下，在相同的激光照射下，2AM-CS NPs对这些蛋白的表达没有明显的影响。
以4AMOS为显像剂的血管NIR-II图像显示，股动脉图像决定的SBR高达3.0，显示出体内成像的高空间分辨率。因此，可以通过NIR-II荧光成像对4AM-OS NPs的血液循环进行半定量分析，确定为~3.5 h。此外，通过NIR-II荧光估计两种NPs在肿瘤中的最大富集时间为~24 h。生物分布分析进一步证实了肿瘤中肿瘤的高富集。最后，采用4T1荷瘤小鼠，在功率密度为0.3 Wcm-2 （808 nm激光）低于皮肤最大允许暴露（MPE）极限的近红外照射下，评估4AM-OS NPs的体内治疗效果。随机分为5组，每组n=3只。5组小鼠分别在激光照射下静脉注射PBS（对照组）、不经激光照射的2AM-CS NPs （2AM-CS -组）和经激光照射的2AM-CS NPs （2AM-CS +组）、不经激光照射的4AM-OS NPs （4AM-OS -组）和经激光照射的4AM-OS NPs （4AM-OS +组）。经过14天的治疗，4AM-OS NPs有效地将肿瘤大小缩小了一半，没有复发。2AM-CS +组仅抑制肿瘤生长，而肿瘤体积增加近2倍。此外，2AM-CS -组和4AM-OS -组的肿瘤生长与对照组无显著差异。然后，采用苏木精和伊红（H&E）染色进行组织病理学分析，分析肿瘤组织形态。与2AM-CS NPs相比，4AM-OS NPs辐照后肿瘤坏死面积更大，表明肿瘤损伤严重。还进行了末端脱氧核苷酸转移酶介导的缺口末端标记（TUNEL）和caspase-3染色试验。与其他组相比，4AM-OS +组进一步证实凋亡细胞较多，与H&E结果和体外WB结果吻合较好。单克隆抗体Ki67免疫荧光染色法观察肿瘤组织细胞增殖情况。4AM-OS +组几乎没有荧光，而对照组肿瘤组织中有较强的红色荧光。该结果表明，4AM-OS NPs的PDT效应完全抑制了肿瘤细胞的增殖。此外，用红外热像仪监测2AM-CS +和4AM-OS +组肿瘤表面温度。在15分钟的照射过程中，温度不会超过43°C，这证实了在这些处理条件下，光热效应最小在治疗期间没有发现明显的体重减轻，表明4AM-OS具有良好的体内应用生物相容性。
总结
具有开壳双自由基特性的4AM-OS在进行电子转移介导的i型光动力学反应方面表现出优于封闭壳2AM-CS的能力。各种表征表明，4AMOS表现出热可达的开壳态Tt，表明在较高温度下，更多的未配对电子将沿π共轭主链稳定和离域。进一步的研究表明，开壳层电子结构通过促进光诱导电荷分离/转移和增强ISC来增强i型PDT。因此，4AM-OS在低氧肿瘤中表现出优异的治疗效果，表现为与电子转移相关的光动力和光催化反应。近红外光激发的光敏剂通常具有较大的π共轭结构，能够稳定有机自由基。
参考文献
The Role of Open-Shell Organic Radical in Enhancing Anti-Tumor Photocatalysis Reaction of NIR Light-Activated Photosensitizer,Heng Li, Ying Gu , Yafei Ding, Jia Huang, Zhiqiang Yang, Pengbo Ding, Mengying Wang, Liang Han, Bing Yang, Liang Guo, Yuanzhu Zhang, Feng He, and Leilei Tian,Angew. Chem. Int. Ed. 2025, e202423023,doi.org/10.1002/anie.202423023
