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内容提要

    我们通过用甲氧基取代的三苯胺部分修饰氮杂硼二吡咯亚甲基（aza-BODIPY），设计并合成了一种一体化光诊疗剂 OTAB，然后通过与 DSPE-PEG2000-cRGD 自组装形成纳米粒子 OTAB@cRGD NPs。甲氧基修饰的三苯胺部分作为强电子供体，可通过产生强分子内电荷转移态来减小单重态 - 三重态能隙（ΔE _{S1-T 1}），从而加速系间窜越过程，进而优先通过电子转移生成超氧阴离子（O₂^·--）。单一的 808 纳米激光可以触发其 NIR-II 成像以及出色的 I 型光动力和光热治疗。OTAB@cRGD NPs可通过静脉注射主动靶向肿瘤组织，成功实现肿瘤定位和成像诊断。

OTAB@cRGD NPs的设计与合成

    通过经典的 O'Shea 合成路线，将作为供体的甲氧基修饰三苯胺部分与氮杂硼二吡咯亚甲基（aza-BODIPY）核心结构共价连接。鉴于 OTAB 具有高度疏水性，我们使用含有靶向肽环精氨酸 - 甘氨酸 - 天冬氨酸（cRGD）的脂质体 DSPE-PEG2000-cRGD 作为纳米载体，通过纳米沉淀法包裹 OTAB，形成 OTAB@cRGD NPs。动态光散射（DLS）测量结果显示，OTAB@cRGD NPs 的水化动力学直径为 102nm，聚合物分散指数（PDI）为 0.204。扫描电子显微镜（SEM）图像表明，纳米粒子呈球形，大小均匀。OTAB@cRGD NPs 在 860nm 附近还表现出近红外吸收峰，与单独的 OTAB 分子相比，该吸收峰略有红移。在 808nm 激光照射下，OTAB@cRGD NPs 在 1069nm 处呈现荧光发射峰，这为其后续在近红外二区（NIR-II）的应用奠定了基础。OTAB@cRGD NPs 的 ζ 电位为 - 31.89±3.5mV，脂质体的负表面电荷有助于延长其血液循环时间，并最大限度地减少网状内皮系统的清除。

OTAB@cRGD NPs 的光动力、光热和荧光性能评估

    为了研究 OTAB@cRGD NPs 在 808 nm 激光照射（1.0 W cm^-2）下的光动力治疗性能，以 2',7'- 二氯荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）为指标评估总活性氧（ROS）的生成情况。单独的 DCFH 在 808 nm 激光照射 6 分钟后，其荧光信号几乎保持不变。然而，与 OTAB@cRGD NPs 混合的 DCFH 的荧光强度持续增加，在相同条件下达到 35 倍以上，展现出惊人的光动力性能为了确定 ROS 的类型，使用二氢乙啶（DHE）和二氢罗丹明 123（DHR 123）检测超氧阴离子（O₂^·--），使用 9,10 - 蒽二亚甲基双丙二酸（ABDA）检测单线态氧（¹O₂）。在 OTAB@cRGD NPs 存在的情况下，ABDA 在照射 6 分钟后的吸光度保持不变，这表明制备的纳米粒子不会通过 II 型途径产生。在 808 nm 激光照射下，含有 OTAB@cRGD NPs 的 DHE 和 DHR123 的荧光强度在 6 分钟内急剧增加，反映了其快速的超氧阴离子生成效率。为了进一步验证自由基种类，采用电子顺磁共振（EPR）方法检测超氧阴离子自由基的生成。以 5,5 - 二甲基 - 1 - 吡咯啉 - N - 氧化物（DMPO）为自旋捕获剂，甲醇溶液为环境体系，OTAB@cRGD NPs 在光照条件下比黑暗条件下表现出更高的特征 EPR 信号，这表明 OTAB@cRGD NPs 可以产生超氧阴离子。以 DMPO 为自选捕获剂，水溶液为环境体系检测羟基自由基（OH）。结果表明，在激光照射下，OTAB@cRGD NPs 中未产生羟基自由基的特征峰，这表明没有产生OH自由基。当使用 2,2,6,6 - 四甲基 - 4 - 哌啶酮盐酸盐（TEMP）作为自旋捕获剂检测单线态氧信号时，与单独的 TEMP 相比，未产生明显的 EPR 信号，进一步证实没有产生单线态氧。

    由于 OTAB 中存在柔性的给体 - 受体（D - A）链，推测 OTAB@cRGD NPs 可能会产生大量热能。记录了 OTAB@cRGD NPs 在不同激光功率和不同浓度下的升温曲线。温度升高与激光功率密度和纳米粒子浓度的增加直接相关。特别是，在 808 nm 激光照射(1.0 W cm^-2）下，浓度为(50 mu g mL^-1)的 OTAB@cRGD NPs 的温度从 25.0℃升高到 45.2℃，这足以诱导癌细胞死亡。此外，在 808 nm 激光照射 10 分钟后获得了 OTAB@cRGD NPs 的热红外图像，这进一步证实了纳米粒子具有良好的光热性能。为了定量测量 OTAB@cRGD NPs 将吸收的光能转化为热能的能力，计算出 OTAB@cRGD NPs 的光热转换效率（PCE）为 29.7%。在 808 nm 激光照射下，体外成像显示，随着水介质中 OTAB@cRGD NPs 浓度的增加，NIR-II 荧光信号逐渐增强，且荧光强度与 OTAB@cRGD NPs 的浓度呈正相关。上述实验结果表明，OTAB@cRGD NPs 可用于 NIR-II 荧光成像引导的 I 型光动力/光热协同治疗。

体外光疗

    在 4T1 细胞（小鼠乳腺癌细胞系）和 MDA-MB-231 细胞（人乳腺癌细胞系）与纳米颗粒孵育后，检测肿瘤细胞活力。当浓度达到 30 μg/mL 时，在无光照条件下，超过 80% 的细胞存活，这表明纳米颗粒在黑暗条件下没有明显的毒性。此外，在 25 μg/mL 的浓度下，光照条件下，4T1 细胞和 MDA-MB-231 细胞在 OTAB@cRGD NPs 存在时的存活率均低于 OTAB NPs 存在时的存活率，这证实了靶向纳米颗粒可以增强对乳腺癌细胞的杀伤能力。此外，使用钙黄绿素乙酰甲酯（calcein AM，活细胞呈绿色荧光）和碘化吡啶（PI，死细胞呈红色荧光）对 4T1 细胞进行活 / 死染色分析。在未照射的 4T1 细胞中检测到明亮的绿色荧光，而红色荧光信号可忽略不计，这表明 OTAB NPs 和 OTAB@cRGD NPs 在黑暗中具有生物相容性。相比之下，在 808 nm 激光（\(1.0 W/cm^{2}\)）照射 5 分钟后，OTAB@cRGD NPs 组的死细胞数量显著增加。与照射后的 OTAB NPs 组相比，OTAB@cRGD NPs 组的 4T1 细胞中观察到更强的红色荧光，这表明由于 cRGD 的靶向特性，OTAB@cRGD NPs 可以更彻底地杀死细胞。上述结果表明，OTAB@cRGD NPs 通过光动力和光热疗法具有良好的抗肿瘤细胞能力，最终诱导细胞凋亡。为了进一步验证纳米颗粒的靶向作用，将 OTAB@cRGD NPs 和 OTAB NPs 与 4T1 细胞孵育，并使用近红外二区（NIR-II）成像系统进行分析。随着孵育时间的延长，荧光信号持续增加。孵育 10 小时后，靶向纳米颗粒组的荧光强度比非靶向纳米颗粒组高 1.37 倍。这证明了 OTAB@cRGD NPs 对肿瘤细胞具有优异的靶向作用。为了研究 OTAB@cRGD NPs 产生 ROS 的能力是否依赖氧气，我们在常氧和缺氧条件下进行了细胞内 ROS 产生实验。未用激光照射的 OTAB@cRGD NPs 处理的 MDA-MB-231 细胞的荧光强度可忽略不计，这表明 OTAB@cRGD NPs 在黑暗中无法产生 ROS。相比之下，激光照射处理后，在常氧和缺氧条件下的 MDA-MB-231 细胞中均观察到绿色荧光，这归因于 ROS 将非荧光的 DCFH-DA 探针氧化为高荧光的 DCF。因此，这些结果证实了 OTAB@cRGD NPs 可以通过 I 型途径产生 ROS，呈现出不依赖氧气的光动力治疗，从而实现卓越的抗肿瘤治疗效果。

OTAB@cRGD NPs 在体内的近红外二区（NIR-II）引导抗癌治疗

    受其出色的近红外二区发射和体外光疗性能的启发，我们进一步评估了其对 4T1 肿瘤的体内成像效果。为了研究 OTAB NPs 和 OTAB@cRGD NPs 的生物分布情况，选择荷 4T1 肿瘤的 BALB/c 小鼠在不同时间点（0、3、6、9、12、24 和 48 小时）进行近红外二区成像监测。当肿瘤长至约 100 mm³ 时，通过小鼠尾静脉注射 OTAB@cRGD NPs 和 OTAB NPs，以捕获肿瘤的近红外二区图像（808 nm，(0.3 W/cm²) ）。OTAB NPs 在肿瘤部位的积累不足。然而，OTAB@cRGD NPs 在肿瘤部位的荧光强度逐渐增加，并在 12 小时达到峰值，随后荧光强度逐渐下降。因此，选择 12 小时作为后续光疗的最佳治疗时间。由于 cRGD 的肿瘤靶向作用，OTAB@cRGD NPs 优先在肿瘤部位积累。注射 48 小时后，处死小鼠，取出主要器官和肿瘤进行成像和分析。纳米颗粒容易在肝脏和脾脏中积累，这表明 OTAB@cRGD NPs 和 OTAB NPs 主要通过肝脏代谢。与 OTAB NPs 相比，OTAB@cRGD NPs 更倾向于在肿瘤部位积累，这表明含有 cRGD 的 OTAB@cRGD NPs 具有良好的近红外二区肿瘤成像特性，能够实现后续的光动力/光热协同治疗。

    将荷 4T1 肿瘤的 BALB/c 小鼠随机分为六组，分别通过尾静脉注射磷酸盐缓冲液（PBS）、OTAB NPs 和 OTAB@cRGD NPs。注射 12 小时后，照射组接受 808 nm 激光照射（(0.8 W/cm²) ）。体内光热成像显示，由于 OTAB@cRGD NPs 选择性地在肿瘤区域积累，经 808 nm 激光照射后，OTAB@cRGD NPs 处理的小鼠肿瘤温度升高了 18.7℃，证实了 OTAB@cRGD NPs 在体内具有出色的光热性能。然而，由于 OTAB NPs 缺乏主动靶向能力，其处理组的肿瘤温度仅升高约 10.3℃，而 PBS 处理组未观察到明显的温度升高。进一步在荷 4T1 肿瘤的 BALB/c 小鼠中评估 OTAB@cRGD NPs 或 OTAB NPs 的体内光疗效果。在治疗期间，每两天监测一次肿瘤体积和体重，以评估治疗效果。肿瘤照片、肿瘤体积和肿瘤重量的结果显示，在没有激光照射的情况下，PBS、OTAB NPs 和 OTAB@cRGD NPs 组的肿瘤迅速生长，几乎没有抗肿瘤效果。在 808 nm 激光照射下，OTAB NPs 的肿瘤抑制率为 56.6±18.3%，这归因于纳米颗粒的增强渗透和滞留（EPR）效应。令人鼓舞的是，在接种后 16 天，OTAB@cRGD NPs 处理的小鼠的肿瘤体积明显小于对照组小鼠。由于高效的光动力 / 光热协同治疗，OTAB@cRGD NPs 的肿瘤抑制率为 87.9±7.8%，这进一步显示了其在对抗肿瘤方面出色的 I 型光动力 / 光热协同治疗效果。

总结

    我们成功设计并合成了一种新型的基于近红外二区（NIR-II）氮杂硼二吡咯亚甲基（aza-BODIPY）的光诊疗系统，该系统通过调节带隙，将 NIR-II 成像以及 I 型光动力疗法（PDT）和光热疗法（PTT）的特性结合起来。借助给体 - 受体 - 给体（D–A–D）策略，OTAB 的发射峰成功达到 NIR-II 区域。通过与 DSPE-PEG2000-cRGD 自组装形成 OTAB@cRGD NPs 后，单一的 808 纳米激光即可实现 NIR-II 成像诊断和治疗的一体化。这些纳米粒子展现出优异的超氧阴离子（O₂^·-)生成能力，可用于 I 型 PDT。此外，OTAB@cRGD NPs 还具有良好的光热转换效率。体外和体内实验表明，OTAB@cRGD NPs 可作为一种一体化的光诊疗试剂，用于 NIR-II 成像引导的 I 型 PDT/PTT 协同治疗。

参考文献

Donor modulation brings all-in-one phototheranostics for NIR-II imaging-guided type-I photodynamic/photothermal synergistic cancer therapy†,Yuxin Ren, Xinyi Zhang, Ling Li, Qiong Yuan, Benkai Bao, Meiqi Li and Yanli Tang,Chem. Sci.,https://doi.org/10.1039/d4sc08685f