内容提要
通过采用电子受体工程策略来调节染料的激发动力学过程，我们设计了一系列近红外（NIR）染料在这些染料中，Hcy-ON通过优化染料的激发态的能量释放途径，在760 nm下照射时，通过温和光热疗法（MPTT）与光动力疗法的协同作用，Hcy-ON在300 mW/cm2的安全光剂量下用单次治疗成功地消融了小鼠模型中的肿瘤。
化合物的合成及光物理性质研究
通过对染料采用调整电子-受体工程策略，将含有不同数量氰基的电子-受体片段掺入分子中，通过Knoevenagel缩合反应获得三种供体-π-受体（D-π-A）结构类似物来实现的（即Hcy-OO、Hcy-ON和Hcy-NN）。使用π桥连接电子供体（D）和电子受体（A）以形成D-π-A结构可以减小电子能级间隙并促进系间交叉（ISC）过程。这导致波长的红移并提高ROS的产生产率。随着电子受体片段中氰基数目的增加，吸电子能力增强。Hcy-ON和Hcy-NN在700-800 nm范围内表现出优异的吸收特性，增强了光的组织穿透，从而提高了治疗效果。由于在基于二氧杂蒽的支架中存在可自由旋转的二苯胺基团，我们进一步探索了它们在四氢呋喃（THF）溶液中的AIE特征，其中磷酸盐缓冲盐水（PBS）级分（fPBS）从0变化到100%。如预期的，随着PBS含量的增加，三种分子的荧光强度逐渐增强。这一观察结果清楚地显示了上述染料的AIE性质。为了进一步评估三种染料在溶液中的ROS生成能力，使用2′，7 ′-二氯二氢荧光素（DCFH）作为ROS荧光指示剂。染料显示出不同的ROS生成能力，其中Hcy-ON在暴露于760 nm激光后显著增强DCFH的荧光强度。DCFH的发射强度超过200倍，表明与其它染料相比，Hcy-ON的上级ROS产生效率。此外，商业PS二氢卟酚e6（Ce 6）和玫瑰红（RB）由于它们的短激发波长而在相同的光照条件下显示出最小的荧光增强。1，3-二苯基异苯并呋喃（DPBF）、羟苯基荧光素（HPF）和二氢罗丹明123（DHR 123）分别用作1O2、·OH和O2·−的指示剂，为了进一步评估由所设计的化合物产生的ROS的类型。
溶剂中的光热和光声评价
测量Hcy-OO、Hcy-ON和HcyNN溶液在相同功率密度下的温度变化以评估其光热效率。（ΔT = 29.1 °C）和HcyNN（ΔT = 18.5 °C）显著提高了760 nm激光连续照射下的溶液温度（800 mW/cm2），而Hcy-OO在671 nm激光照射下表现出弱的光热性能（800 mW/cm2）。这种差异可能归因于氰基的引入，其中分子内振动和-C N键的吸电子能力在调节与非辐射弛豫竞争的ISC中起着至关重要的作用。此外，我们观察到Hcy-NN的光稳定性在以前的ROS测试中很差。即使在低光功率条件下，（100 mW/cm2）时，其特征吸收峰显著降低，并且可以用肉眼观察到照射前后溶液中的明显颜色变化。我们重点评估了Hcy-ON的光热效率。HcyON水溶液中的温度升高速率与其浓度和激光功率强度之间存在正相关性。在PTT期间，可以精确调节Hcy-ON产生的用于MPTT的热量。值得注意的是，根据加热-冷却曲线，Hcy-ON的PCE可达49.91%，分子到达激发态后的非辐射弛豫行为使分子同时具有光热和PA特性。基于Hcy-ON的优异光热效应，我们进一步研究了Hcy-OO、Hcy-ON和Hcy-NN的PA特性。派在生物组织模型中进行。Hcy-ON和Hcy-OO分别表现出最高和最低的PA强度。
体外细胞毒性和ROS生成
Hcy-OO和Hcy-ON在黑暗条件下没有显示出显著的毒性;当浓度超过50 μg/mL时，Hcy-NN表现出明显的毒性，表明只有HcyOO和Hcy-ON具有较好的生物相容性。只有Hcy-ON表现出优异的光毒性，IC 50值为30.2 μg/mL。在100 μg/mL的浓度下，光照下的最高温度可达到56.6 ℃，表明细胞中令人满意的PTT功效。7-二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）成像证实了细胞内ROS的产生。用Hcy-OO和Hcy-NN孵育的MCF-7细胞在光照下没有显示出显著的荧光，而用Hcy-ON处理的细胞显示出明显的荧光。照射后，Hcy-ON产生的热量和ROS有效地根除肿瘤细胞，突出了其在体外三种分子中优越的上级PTT/PDT协同杀伤潜力。使用双重染色方法视觉评估Hcy-ON对癌细胞的消融作用。对照组和未照射的Hcy-ON组都显示出强的绿色荧光，表明所用的光剂量相对安全，Hcy-ON具有良好的生物相容性。在760 nm光下与Hcy-ON共培养的MCF-7细胞中，几乎所有观察到显著红色荧光的细胞中观察到红色荧光显著增加。这表明细胞死亡，由于PI进入受损的细胞膜并特异性结合核分裂释放的DNA双螺旋。
同型半胱氨酸诱导细胞死亡机制的研究
在体外证实了Hcy-ON对癌细胞的有效细胞毒性后，进一步阐明了近红外光照射下诱导的细胞死亡途径。在共聚焦显微镜下，在对照组、光组和Hcy-ON组中没有观察到荧光。与此形成鲜明对比的是，“HcyON +光”组在细胞膜上显示出显著的绿色荧光，表明膜联蛋白V与暴露的磷脂酰丝氨酸特异性结合，其翻转到外膜。当PI进入细胞并与游离DNA结合时，在细胞核上观察到红色荧光，表明膜损伤和细胞核破裂。这种双重荧光模式表明细胞完全解体和凋亡的高级阶段，证实Hcy-ON通过NIR光子激活诱导细胞死亡。值得注意的是，线粒体膜电位（MMP）降低是细胞死亡的常见特征。42因此，我们使用MMP依赖性探针JC-1进一步研究细胞死亡模式。在健康细胞中，MMP高，JC-1在线粒体基质中形成聚集体（JC-1聚集体），在共聚焦显微镜下发出红色荧光。当细胞受损时，MMP去极化，导致MMP减少，因此JC-1不能聚集，而是以单体形式存在（JC-1单体），其与共聚焦成像过程中观察到的绿色荧光相关。使用羰基氰化物3-氯苯肼（CCCP）作为对照，其作为线粒体氧化磷酸化解偶联剂，与JC-1共培养的MCF-7细胞的共聚焦成像显示，对照组和Hcy-ON组在没有光照的情况下显示红色荧光，在NIR光照射下，与Hcy-ON共孵育的细胞显示出绿色荧光，表明JC-1以单体形式存在并损伤MMP，随后，通过流式细胞术进行的Annexin V-FITC/PI染色表明，与对照组相比，与Hcy-ON共培养的MCF-7细胞在760 nm照射下经历了显著的凋亡，这些发现与JC-1染色和AV/PI染色的结果一致。Hcy-ON表现出优异的生物相容性，有效地靶向癌细胞并在NIR激光激活时诱导细胞凋亡。
体内多模式成像和协同PTT/PDT
将MCF 7细胞与不同浓度的Hcy-ON一起孵育，然后用PBS冲洗并更换为新鲜的培养基。在短脉冲激光照射下，在用Hcy-ON处理的细胞中观察到清晰的PA信号，沿着具有明显的细胞轮廓。这些发现与从体模测试获得的结果一致，证明PA信号的强度与Hcy-ON的浓度之间呈正相关。这证实了Hcy-ON在体外具有优异的派能力。在体外获得有希望的初步结果后，由Hcy-ON的有效非辐射跃迁/IC驱动，我们进一步评估了Hcy-ON在体内产生PA信号的能力。瘤内注射Hcy-ON后，通过在不同时间点捕获PA信号图像来监测PA信号产生。注射前在肿瘤部位没有检测到PA信号。随后，PA信号在注射后立即在肿瘤区域可见;但由于未完全浸润，PA信号强度和覆盖范围均不明显，在30 min内，Hcy-ON完全浸润肿瘤导致PA成像范围扩大，PA信号强度峰值增大，甚至在注射后150 min仍保持较强PA信号，另外，在600 mW/cm²照明下，对照组中肿瘤区域温度略微升高，而照明组中明显出现显著的温度升高，值得注意的是，在300 mW/cm2的光功率密度下，肿瘤区域温度达到44.8 °C，在600 mW/cm2下上升到58.1 °C，强调了其出色的PCE。因此，我们选择300 mW/cm2作为随后MPTT肿瘤消融的相对温和的设置。
在证实了Hcy-ON双模式成像和MPTT治疗方案的有效性后，我们的目标是实现Hcy-ON在小鼠中对人乳腺癌（MCF-7）的协同PTT/PDT。为了确保Hcy-ON在肿瘤中的富集，通过单次瘤内注射治疗裸鼠，每2天记录肿瘤体积、小鼠体重和肿瘤外观数据。治疗方案，包括肿瘤内注射1小时后20分钟的760 nm激光（300 mW/cm2，360 J/cm2）照射。虽然对照组和Hcy-ON组中的肿瘤快速生长，但“Hcy-ON + Light”组显示出显著的肿瘤抑制作用;即，肿瘤逐渐从黑色结痂消退并在很大程度上愈合。在治疗期间，小鼠体重保持稳定，未观察到明显的突变随后，我们通过组织学和免疫组织化学研究进一步评估了Hcy-ON的治疗效果。苏木精和伊红（H&E）染色结果显示，由NIR激光介导的Hcy-ON的治疗效果和ROS的产生引起了对肿瘤组织的广泛损伤，光处理组可见大量空泡和明显的核固缩，而其他两组可见密集的肿瘤细胞群，末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记（TUNEL）检测显示光处理组仅可见丰富的红色荧光，证实Hcy-ON与PDT/PTT联合治疗后肿瘤组织细胞发生严重凋亡。切除的肿瘤组织的Ki 67染色分析显示，只有“光+ Hcy-ON”PDT/PTT联合Hcy-ON治疗组的标记率较低，提示PDT/PTT联合Hcy-ON治疗具有良好的预后和降低肿瘤复发的可能性。
总结
本研究通过对吸电子工程策略的优化，引入了三种具有AIE特性的新型多功能染料Hcy-OO、Hcy-ON和Hcy-NN，通过改变氰基数目，在分子构象和给受体电子结构水平上精确调控分子性质，经过全面的分子理论计算和一系列的体内外研究，我们发现Hcy-ON在本研究所用的染料中表现出最好的性能，值得注意的是，由于其独特的D-π-A结构和氰基调节，Hcy-ON在760 nm处表现出近红外激发和高活性氧产率（1O2，·OH），表现出优异的I型和II型PDT能力。多个自由旋转单键和吸电子基团的存在，Hcy-ON具有良好的PTT能力，以及派和PTI的双模式成像能力。与其他传统治疗诊断染料相比，Hcy-ON具有扩展的激发波长和上级的派性能，有效解决了成像穿透深度不足的问题。
参考文献
Leveraging an Electron-Acceptor Engineering Strategy to Regulate Excitation Dynamics of Dyes for Devising Ideal Phototherapeutic Agents in Synergistic Photodynamic/ Mild-Photothermal Tumor Therapy,Yifu Hao, Jingyun Wang , Jiahui Wang , Zhihan Guo, Xiaosheng Liu, Shuangshuang Lv , Qinghai Hu , Kejin Huo, Qichao Yao , Jian Jiang , Shuang Zeng *, Heemin Kang , Xiaojun Peng , Juyoung Yoon* & Haidong Li *,CCS Chem. ,https://doi.org/10.31635/ccschem.024.202405048
