内容提要
本文通过结合给体基团工程和氟化工程的双策略方法，构建了一系列具有聚集诱导发射（AIE）、NIR-II荧光成像（FLI）、I型光动力治疗（PDT）和温热治疗（PTT）功能的近红外第二光敏剂（NIR-II）。利用充分的分子转子和氟的高电负性，所制得的2-（2-（5-（4-（二苯基氨基）苯基）（苯基）氨基）苯基）噻吩-2-基)亚甲基)5,6-二氟-3-氧-2,3-二苯基氨基)苯基)噻吩-2-基)亚甲基（BTS-2F）和2-（2-（5-（4-（二苯基氨基）苯基）苯基）亚甲基）-5,6-二氟-3-氧-2,3-二氢- 1h -吲哚-1-乙炔)丙二腈（TTS-2F）具有NIR-II AIE性质。高自由基活性氧（ROS）生成能力和温和的光热转化。通过薄膜水化法，制备的BTS-2F和负载TTS-2F脂质体在体外和原位4T1小鼠模型中均表现出明显的NIR-II FLI和改善的i型PDT/温温PTT治疗。
分子设计和光物理性质
BTS-2F、BTS-2Cl、TTS-2F和TTS-2Cl相对于TS的三苯胺单元具有延伸的供体基团，以探索延伸的供体段和氟化对其光物理性质、系统间交叉过程和光治疗效果的影响。根据先前的报道，供电子部分N，N-二苯基-4-（噻吩-2-基）苯胺由于其分子框架的扩展偶联，有利于构建高效的近红外光疗剂，这对促进ICT产生了积极的影响，并导致更低的电子带隙，以及更长的吸收和发射波长。延长的三苯胺节段（作为给体）不仅极大地提高了给电子能力，而且提供了足够的自由旋转部分的旋转，这可以消耗光激发时的激子能量，从而在溶液中不发射或弱发射。以胆固醇（Chol）和1,2-二棕榈酰基-甘油酸-3-磷脂胆碱（DPPC）为包封基质，通过薄膜水合法制备BTS-2F Lip、BTS-2Cl Lip、TTS-2F Lip和TTS-2Cl Lip。通过动态光散射（DLS）和透射电子显微镜（TEM）检测，这些唇形结构具有明显的水分散性，BTS-2F唇形的平均水动力直径为68.08 nm， BTS2Cl唇形为58.77 nm， TTS-2F唇形为78.82 nm， TTS-2Cl唇形为68.06 nm。在808 nm照射下，BTS2F Lip、BTS-2Cl Lip、TTS-2F Lip和TTS-2Cl Lip的PL光谱分别在970、928、1040和1088 nm处达到峰值，这与它们在固态时的PL强度一致。值得注意的是，BTS-2F Lip、BTS-2Cl Lip、TTS-2F Lip和TTS-2Cl Lip在磷酸盐缓冲液（PBS）和PBS + 10%胎牛血清（FBS）溶液中均表现出7天的优异储存稳定性。为了研究它们的生物成像能力，我们测量了BTS-2F Lip、BTS2Cl Lip、TTS-2F Lip和TTS-2Cl Lip的PL光谱和相对量子产率（QY）。以IR-26为参考，测定BTS-2F Lip、BTS-2Cl Lip、TTS2F Lip和TTS-2Cl Lip在水中的QYs分别为4.13%、3.32%、5.67%和4.05%。为了验证这些Lips的潜在协同光疗作用，我们系统地评估了BTS-2F Lip、BTS-2Cl Lip、TTS-2F Lip和TTS-2Cl Lip的ROS生成和光热转化能力。以2 ',7 ' -二氯二氢荧光素（DCFH- da）为指示剂检测总ROS生成，随着持续的白光照射（20 mW cm−2），在BTS-2F Lip、TTS-2F Lip、BTS-2Cl Lip和TTS-2Cl Lip存在时，二氯二氢荧光素（DCFH）的绿色荧光逐渐增强，而单独存在DCFH时。对于BTS-2F Lips，照射5min后，DCFH的荧光强度增加到近50倍。为了进一步鉴定ROS的种类，分别用羟基苯基荧光素（HPF）、二氢霍达明123 （DHR 123）和单线态氧传感器绿（SOSG）检测羟基自由基（•OH）、超氧阴离子（O2•−）和1O2。在连续白光照射下，在BTS-2F Lip、BTS-2Cl Lip、TTS-2F Lip和TTS2Cl Lip的存在下，DHR 123的荧光强度分别达到照射前的33倍、25倍、16倍和10倍以上，而仅DHR 123组检测到的荧光信号可以忽略不计，说明BTS-2F Lip的O2•−生成效率更高。此外，HPF和四甲基联苯胺（tetramethylbenzidine， TMB）指示剂也检测到BTS-2F Lip具有突出的•OH生产效率。以上结果表明，BTS-2F Lip倾向于通过i型工艺快速生成•OH和O2•−，而不是通过ii型工艺生成1O2。同时，电子自旋共振（EPR）测量证实了•OH和O2•−经过ISC生成三重态激发态，其中THF中BTS-2F、BTS-2Cl、TTS-2F和TTS-2Cl均检测到明显的EPR信号，且信号从溶液态向固态增强。
光热性质研究
通过记录辐照后的温度变化，评价了这些Lips在PBS溶液中的光热转换性能。在660激光照射（0.3 W cm−2）时，随着激光照射浓度（0、50、100和200 μg mL−1）和功率密度（660 nm、0、0.3、0.5和1 W cm−2）的增加，BTS-2F Lip、BTS-2Cl Lip、TTS-2F Lip和TTS-2Cl Lip的温度迅速升高。在660激光（0.3 W cm−2）照射5min后，TTS-2F Lip的温度可达60.7℃。此外，根据所报道的方法计算出BTS-2F Lip、BTS-2Cl Lip、TTS-2F Lip和TTS2Cl Lip的光热转换效率（pce）分别为39.0%、47.3%、42.6%和48.0%，远高于已有报道的光热剂（菁染料≈26.6%,ICG≈3.1%）。同时，BTS2F Lip、BTS-2Cl Lip、TTS-2F Lip和TTS-2Cl Lip处理后的热信号可以通过光热成像PTI识别。
体外实验
我们选择乳腺癌作为研究对象。4T1是一种起源于BALB/c小鼠乳腺自发肿瘤的乳腺肿瘤细胞系。这种高度侵袭性的致瘤细胞在生长、转移和扩散方面的行为与人类乳腺癌非常相似。此外，4T1细胞在小鼠体内容易形成肿瘤，这有利于肿瘤模型的构建。首先，采用甲基噻唑四氮唑（MTT）法评价BTS2F Lip和TTS-2F Lip在正常氧和缺氧条件下对4T1细胞的体外杀伤效果。无论在正常氧或缺氧状态下，BTS-2F Lip、BTS-2Cl Lip、TTS-2F Lip和TTS-2Cl Lip在高浓度200 μg mL−1下对4T1细胞的暗细胞毒性均可忽略不计。此外，在660 nm （0.5 W cm−2）激光照射5分钟后，BTS-2F Lip和TTS-2F Lip的细胞活力显著降低，表明它们具有较高的光细胞毒性。为了进一步验证其抗肿瘤有效性，BTS-2F NPs也被应用于CT26结肠癌细胞系，同样取得了良好的治疗效果。此外，BTS-2F Lip和TTS-2F Lip辐照后表现出良好的光细胞毒性，在缺氧条件下可杀死约75%的癌细胞，这是由于i型ROS生成过程和出色的光热治疗效果，其中受激发的光敏剂与邻近底物之间的电子转移产生自由基如图所示，通过共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）和用1,1″-二-n-octadecyl3,3,3″，3″-四甲基多碳青高氯酸盐（DiL）、Lysotracker Green和4 '，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）共染色实验证明，BTS-2F Lip、BTS-2Cl Lip、TTS-2F Lip和TTS2Cl Lip主要特异地锚定在溶酶体上。为了确认细胞内通过i型过程生成•OH的能力，我们以羟基苯基荧光素（Hydroxyphenyl Fluorescein， HPF）为指标，对BTS-2F Lip和TTS-2F Lip的•OH生成进行了评价。只有在激光照射（660 nm, 0.5 W cm−2）下，BTS-2F Lip和TTS-2F Lip培养的细胞中才观察到亮绿色荧光，且TTS-2F Lip组的绿色荧光强度较BTS-2F Lip组略有下降，这与图中的结果一致。为了进一步验证BTS-2F Lip和TTS-2F Lip的光疗效果，采用双醋酸荧光素（FDA）和碘化丙啶（PI）作为荧光探针分别监测活细胞和死细胞，进行共染色实验。在激光照射下，BTS-2F Lip和TTS-2F Lip组的PI发出了明显的红色荧光信号，而其他组只发出了绿色荧光，说明BTS-2F Lip和TTS-2F Lip对照射后的癌细胞具有协同光疗作用。此外，利用Annexin V-FITC检测的流式细胞术分析也对癌细胞的死亡机制进行了评价。在激光照射（0.5 W cm−2,15 min）下，BTS-2F Lip处理4T1细胞后，64.6%的细胞参与凋亡，而TTS-2F Lip的比例为42.2%，高于其他组（PBS组2.04%，光组2.14%，无激光组2.25%，无激光组2.37%）。虽然TTS-2F的光热性能优于BTS-2F，优异的活性氧生成速率使BTS-2F在光动力和光热疗法的协同治疗中表现出更好的治疗效果。为了确保轻度PTT的治疗效果不受热休克蛋白70 （HSP70）的影响，热休克蛋白70可以通过防止蛋白质变性和细胞损伤来保护细胞免受热应激的影响。检测不同处理条件下肿瘤细胞中HSP70的表达。
体内NIR-II成像和协同光疗
静脉注射TTS-2F Lip后，肿瘤区域的NIR-II荧光信号强度随时间逐渐增加，表明具有明显的肿瘤靶向能力，体外实验结果也是如此。同时，在尾静脉注射TTS-2F Lip后，光声信号在12 h达到最大值，并维持24 h。NIR-II荧光成像与PAI的协同作用可为光疗过程中肿瘤区域的可视化和指导照射时间提供准确的信息。此外,PTI实验是由一个FLIR热成像照相机TTS-2F唇静脉注射后12 h。老鼠体内的肿瘤区域的温度post-injected TTS-2F唇和BTS-2F嘴唇迅速增加从34.5到48.2°C和5分钟后从34.7到46.3°C下激光辐照(660 nm, 0.3 W厘米−2),分别揭示潜在的缓和的温度phototherapeutic应用程序。相比之下，pbs处理小鼠的温度升高可以忽略不计，表明激光对温度的影响不显著，TTS-2F Lip和BTS-2F Lip的光热性能可靠。为了研究BTS-2F Lip和TTS-2F Lip的体内抗肿瘤效果，将4T1荷瘤小鼠分为6组：PBS、激光、BTS-2F Lip、TTS-2F Lip、BTS-2F Lip+激光和TTS2F Lip+激光。在尾静脉注射BTS-2F Lip和TTS-2F Lip 12 h后，激光组在660 nm （0.3 W cm−2）下照射5 min。在21 d治疗期间，每3天监测6组肿瘤体积和体重。治疗后，PBS、激光、BTS-2F Lip、TTS-2F Lip组肿瘤体积迅速增大，而BTS-2F Lip+激光组肿瘤体积明显减小，治疗结束时最小体积为53.7 mm3，体内抗肿瘤效果显著。在21天的治疗过程中，各组体重的变化可以忽略不计，说明BTS2F Lip和TTS-2F Lip的副作用较小。同时，还提供了小鼠的白色图像，用于可视化体内皮下肿瘤。此外，所有治疗组在治疗30 d期间均未观察到小鼠死亡，BTS-2F Lip+激光组在治疗60 d后存活率维持在40%。为了进一步验证BTS-2F Lip和TTS-2F Lip的体内抗肿瘤机制，我们还进行了组织学和免疫组织化学分析。这些结果充分证实了BTS-2F Lip和TTS-2F Lip在PDT和PTT协同作用下对肿瘤的抑制作用。如图所示，HPF染色图像显示，BTS-2F Lip和TTS-2F Lip处理组在激光照射后产生了明显的绿色荧光，说明这两组处理可以有效生成ROS。而Ki-67免疫荧光染色显示激光照射治疗组BTS-2F Lip和TTS-2F Lip均出现严重的细胞凋亡。经BTS-2F Lip和TTS-2F Lip联合激光照射后，通过tdt介导的dUTP镍端标记（TUNEL）染色和苏木精伊红（H&E）实验进一步验证了肿瘤组织的广泛破坏和肿瘤区域细胞增殖的抑制。而PBS、激光、BTS-2F Lip、TTS2F Lip组肿瘤细胞仍保持致密排列。这些实验结果表明，在激光照射下，基于i型PDT/温温PTT协同治疗，BTS-2F和TTS-2F Lip表现出显著的NIR-II FLI和肿瘤消除。
总结
本文成功开发了一系列具有AIE特征的光治疗剂，NIR-II FLI， I型PDT和温温PTT治疗。通过合理引入DPA基团和氟原子，得到的BTS-2F和TTS-2F具有高扭曲构型、低频振动、ΔEST小、强D-A相互作用，从而具有NIRII AIE性能、高自由基ROS生成能力和温和光热转化能力。通过以Chol和DPPC为包埋基质的薄膜水化方法，生物相容性BTS-2F Lip和TTS-2F Lip在NIR-II fli引导的i型PDT/温温PTT体外和原位4T1小鼠模型中均表现出在肿瘤区域的有效蓄积和激光照射下的显著性能。这些贡献为促进光治疗平台进入临床试验的发展提供了一种新的先进光治疗材料设计策略。
参考文献
NIR-II AIE Liposomes for Boosting Type-I Photodynamic and Mild-Temperature Photothermal Therapy in Breast Cancer Treatment，Shijie Zhen, Zhe Xu, Meng Suo, Teng Zhang, Meng Lyu, Tianwei Li, Tianfu Zhang,* Meijing Li,* Zujin Zhao,* and Ben Zhong Tang*，Adv. Mater. 2024, 2411133， https://doi.org/10.1002/adma.202411133
