行业文献

内容提要

   低氧诱导的肿瘤转移严重阻碍了光动力学疗法（PDT）在肿瘤治疗中的疗效。目前的策略主要提供HIF-1α通路的姑息性抑制，强调迫切需要创新的PDT方法从一开始就预防转移。典型的PDT触发细胞质Ca²⁺水平的增加，激活HIF-1α，降低Ca²⁺水平反过来可以减轻转移。考虑到细胞质中的钙储存和调节的作用，我们建议PDT诱导的转移可以解决其来源的精确细胞内定位的光敏剂（PS）。我们开发了具有固有核靶向能力的近红外（NIR）花青PS。这些PS有效抑制照射后胞浆Ca²⁺升高，降低HIF-1α活性，在4 T1肿瘤中具有显著的抗转移作用。

PDT诱导肿瘤转移时胞浆Ca²⁺的释放

   为了阐明传统PDT中Ca²⁺水平与HIF-1α之间的内在联系，采用二氢卟酚e6（Ce 6）作为典型的靶向HIF-1 α的PS。为了改善PS的生物利用度和摄取，使用主动加载方法将其包封在脂质体双层中。首先，我们使用绿色荧光探针Fluo-4AM研究Ce 6-PDT后细胞质Ca²⁺水平。共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）图像在无激光组中产生弱信号，表明4 T1细胞中细胞内Ca²⁺含量低。在激光照射后，在Ce 6组的细胞质内观察到绿色荧光增加3倍（称为Ce 6-PDT），表明细胞质Ca²⁺升高。PDT引起的ROS升高可导致胞浆内Ca²⁺从线粒体漏出。用钙螯合剂BAPTA-AM（称为Ce 6-B）进一步处理减弱荧光，表明细胞质Ca²⁺可以被BAPTAAM调节。我们检测了靶向PDT后HIF-1α的细胞内分布。使用Alexa Fluor 647标记的二抗的荧光信号，使用CLSM监测HIF-1α。对照组HIF-1α主要定位于胞浆，仅21.6%定位于胞核。值得注意的是，PDT后67.8%的HIF-1α存在于细胞核中，表明HIF-1α的活性和稳定性增加，并表明在Ce 6-PDT处理下HIF-1α积累并易位至细胞核。具有丰富的HIF-1稳定性的肿瘤更容易转移复发。进一步用BAPTA-AM（一种钙离子螯合剂）处理可恢复HIF-1α在细胞内的分布，其中23.4%的HIF-1α位于细胞核内。在Ce 6-PDT后，HIF-1α的总体表达上调，但在用BAPTA-AM处理后，HIF-1α的总体表达受到抑制。此外，这些结果与通过Western印迹法测量的HIF-1α表达水平一致。这些结果表明，Ca²⁺螯合剂可以有效地抑制HIF-1α的活性，并表明细胞内Ca²⁺水平和HIF-1α的调节之间存在实质性的相关性。为了评估Ca²⁺抑制是否可以减少靶向PDT后的肿瘤转移，用Ce 6-PDT或Ce 6-B-PDT（Ce 6 + BAPTA-AM +激光）处理4 T1荷瘤小鼠。在20天的治疗后，肺组织的苏木精和伊红（H&E）染色表明Ce 6-PDT组表现出相当大的肺转移，而Ce 6-B-PDT组表现出显著更少的肺转移部位。Ce 6-B PDT导致比Ce 6-B更少的肿瘤细胞迁移和侵袭，因此证明Ca²⁺抑制可以减轻靶向肿瘤的PDT后的转移。

核靶向PSS的设计与合成

   菁荧光团是一类近红外染料，具有高穿透性的固有结构特征，具有作为PS的巨大潜力。认识到强DNA结合增强了有机染料的细胞核靶向能力我们将核穿膜染料噻唑橙子（TO）50−52的官能团进入五甲川花青支架，得到NIR-PS TP和QP。我们首先利用分子对接方法研究了DNA分子与三种PS（Ce 6、QP和TP）之间的结合能。TP和QP表现出较低的吉布斯自由能（−60.54和−52.01 kcal/mol），而Ce 6表现出最高的吉布斯自由能（2.31 kcal/ mol），因此表明TP和QP具有较强的DNA结合能力。TP和QP的荧光随着DNA浓度的增加而增强，进一步证实TP和QP均可轻松锚定DNA。在此基础上，我们对PS在4 T1细胞中的亚细胞定位进行了研究。在4 T1细胞中，PS的亚细胞定位与PS的表达有密切关系。TP和QP主要位于细胞核中。QP和TP与细胞核特异性DAPI的Pearson相关系数分别高达0.83和0.76。相比之下，Ce 6主要位于线粒体中，与线粒体追踪器的相关系数较高（0.92）。对于Ce 6、TP和QP，4 T1细胞核中总荧光辐射的百分比分别为16%、69%和80%。总之，这些结果表明，TP和QP可以靶向细胞核，具有在PDT处理期间控制胞质Ca²⁺水平的潜力。

核靶向光动力治疗对Ca²⁺和HIF-1α的影响

   鉴于TP和QP定位于4 T1细胞的细胞核内，我们研究了细胞核靶向PDT是否改变了胞质Ca²⁺水平。正如预期的那样，我们观察到TP和QP组中暴露于或未暴露于激光照射的细胞中Ca²⁺荧光的差异可以忽略不计。4 T1细胞中的细胞Ca²⁺含量也使用甲酚酞络合剂方法定量。值得注意的是，TP-PDT和QP-PDT组的Ca²⁺含量与对照组无显著差异，而Ce 6PDT组的Ca²⁺含量是对照组的1.3倍，表明细胞核靶向PDT绕过了线粒体靶向PDT中的胞质Ca²⁺内流。随后，我们观察了TP-PDT和QPPDT处理后HIF-1α的表达及其在细胞内的分布。HIF-1α主要位于细胞质内，4 T1细胞核内总荧光辐射的百分比约为22−25%。这一结果与对照组观察到的结果相似，表明HIF-1α在靶向细胞核的PDT过程中保持无活性。Westernblot分析证实，TP-PDT和QP-PDT处理的4 T1细胞HIF-1α表达水平仅为对照组的1.5%（P < 0.05），QP-PDT处理的4 T1细胞HIF-1α表达水平仅为对照组的1.5%（P < 0.05）。分别为Ce 6-PDT组中表达水平的29%和43%。采用简单的线性回归模型评估4 T1细胞中Ca²⁺含量与HIF-1α荧光强度之间的相关性。如图所示，4 T1细胞的Ca²⁺含量与HIF-1α的相对表达呈正相关，相关系数（R）为0.81。这些结果表明，核损伤的PDT可以破坏传统PDT中Ca²⁺与HIF-1 α的相互作用。

核靶向光动力治疗的体外抗肿瘤转移能力

   由于 TP-PDT 和 QP-PDT 产生了优于 HIF-1α 的独立结果，因此研究了它们对体外 PDT 的影响。 首先，研究了在 660 nm 激光照射下 PS 产生的 ROS。 电子自旋共振 (ESR) 分析表明 ¹O₂ 是由 PS 在激光照射下产生的。 使用 1,3-二苯基异苯并呋喃 (DPBF) 来评估通过 DPBF 的荧光发射测定的 PS 产生 ¹O₂ 的情况。  TP 和 QP 组的 DPBF 荧光在激光照射 200 秒内显着下降 53−70%。 根据参考Ce6（0.64）计算出TP和QP的ROS量子产率分别约为0.42和0.51。 此外，使用2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）评估细胞内ROS的产生，TP-PDT和QP-PDT后4T1细胞中产生了丰富的ROS。 随后，研究了PSs的光毒性。 当与 6 μM 浓度的 PS 一起孵育而无需照射时，超过 90% 的细胞存活，表明 PS 具有出色的生物相容性。 相反，激光照射导致细胞活力降低，这归因于 ROS 的产生。 使用钙黄绿素-AM和碘化丙啶双染色评估PS的体外肿瘤细胞杀伤效率。 使用三种 PS 进行 PDT 后，Ce6 和 QP 组表现出比 TP 组更高的死细胞百分比，这与细胞毒性测定结果一致。 使用流式细胞术分析研究细胞死亡的机制。 值得注意的是，PDT 通过产生 ROS 诱导肿瘤细胞凋亡（Q2，早期凋亡，Q3，晚期凋亡）和坏死（Q1）。

参考文献

Bypassing Ca2+ Influx for Antimetastasis Photodynamic Therapy viaRobust Nucleus-Targeted Near-Infrared Cyanines，Xianghan Zhang, Huaicong Zhang, Qunyan Dong, Yuan Qin, Yutian Cao, Haixing Zhu, Zimeng Ma,Zehua Li, Zhiping Rao, Pengbo Ning, Zuhong Tian, Yuqiong Xia,* Peng Yang,* and Zhongliang Wang*，Nano Lett. 2024, 24, 15817−15826，https://doi.org/10.1021/acs.nanolett.4c04789