内容提要
本工作星形近红外发射有机光敏剂的正电荷调节可以促进自由基的产生，从而有效治疗多重耐药细菌感染的伤口。通过正电荷工程，具有六个正电荷的TPAT-DNN主要通过I型途径产生羟基自由基，而具有三个正电荷的TPAT-DN倾向于产生单线态氧和超氧自由基。对于多重耐药菌，TPAT-DNN在低浓度下对多重耐药革兰氏阳性菌表现出特异性杀灭作用，而TPAT-DN对多重耐药革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均具有类似的抗菌作用。 此外，在 MRSA 感染的小鼠模型中，TPAT-DNN 在根除多重耐药细菌耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 (MRSA) 感染和加速伤口愈合方面的效率和安全性得到了证明。
结果与讨论
为了实现近红外（NIR）发射，通过给电子供体（D）三苯胺与多个��桥噻吩和受电子受体（A）烯键的共轭构建了阳离子星形TPAT光敏剂。 扩大的三维��共轭有利于分子内电荷转移，从而导致吸收和发射特性红移。 TPAT-DN 和 TPAT-DNN 通过三苯胺与三个噻吩乙烯基的 Stille 偶联轻松合成，然后在三个末端配置吡啶盐或季铵盐。TPAT-DN和TPAT-DNN在300-650 nm范围内表现出相似且广泛的吸收能力，最大吸收为500 nm。激发后 TPAT-DN 和 TPAT-DNN 中存在类似的 NIR 发射信号，峰值位于 684 nm。 进一步测试了 TPAT 的 AIE 性能，结果如图所示。 随着不良溶剂甲苯体积的增加，TPATDN和TPAT-DNN的荧光发射逐渐增强。 值得注意的是，TPAT-DN 和 TPAT-DNN 的荧光强度增强了五倍以上，表明 AIE 良好，可以促进细菌及其相互作用的荧光成像。一般来说，光敏剂产生活性氧（ROS）可以通过两种光化学途径促进，即产生1O2的II型途径和产生·OH和O2·−的I型途径。 为了确定ROS产生途径，使用2',7'-二氯二氢荧光素（DCFH）、9,10-蒽二基双（亚甲基）-二丙二酸（ABDA）、羟苯基荧光素（HPF）和二氢罗丹明123（DHR123）来表征详细的ROS产生途径。TPAT 的 ROS 生成。 如图所示，通过监测 DCFH 荧光随时间的变化来评估总 ROS 生成，结果表明 TPAT-DN 和 TPAT-DNN 的表现分别高出 91 倍和 81 倍。 30 mW cm−2 白光照射下的荧光强度分别远大于传统的亚甲蓝（MB）。 这些结果表明 TPAT 对于总 ROS 生产具有卓越的效率。 白光照射5 min后，TPAT-DN在380 nm处发生明显的时间依赖性吸收降解，而TPAT-DNN在相同条件下引起的变化可以忽略不计，表明TPAT-DNN可能是一种高效O2光敏剂。 和/或 •通过I型途径生成OH，以及TPAT-DN和的1O2量子产率 TPAT-DN 经计算分别为 0.16 和 0.008。 接下来，使用商业ROS指示剂HPF和DHR123来验证TPAT的O2•−和•OH生成。TPAT-DN和TPAT-DNN都可以产生·OH，并且TPATDNN中HPF的荧光增强是TPAT-DN的1.8倍。 在相同条件下使用TPAT-DN将DHR123荧光强度提高34倍时，TPAT-DNN观察到DHR123荧光。 综上所述，TPAT-DNN在每个亲水端含有两个带正电荷的基团，更有可能仅通过I型途径产生ROS，而TPAT-DN在TPAT-DN中发现I型和II型途径均产生ROS ，其每个亲水端都有一个带正电的基团。 然而，具有相似电荷调节模式的 TPAT 类似物 TT2Py1 和 TT2Py2 在 I 型和 II 型 ROS 生成方面表现出不相关的趋势。
受其有效产生ROS能力的启发，使用标准平板菌落计数方法进一步研究了TPAT的体外抗菌活性。在没有白光照射的情况下，与不同浓度的TPAT一起孵育后，革兰氏阴性菌大肠杆菌(E.coli)或革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌(S.aureus)的存活率没有显着变化。 然而，在30 mW cm−2的白光照射30 min后，TPAT-DN和TPAT-DNN表现出相似的浓度依赖性抗菌活性，杀死> 99％的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌菌株的浓度约为 分别为2μm和8μm。 这些结果证明了这些分子对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的有效抗菌性能。 为了进一步研究 TPAT 与细菌的相互作用，将大肠杆菌和金黄色葡萄球菌与 TPAT 一起孵育 10 分钟，然后通过共焦激光扫描显微镜 (CLSM) 成像。 如图所示，TPAT-DN和TPAT-DNN对金黄色葡萄球菌表现出相似的细菌膜锚定能力。对于大肠杆菌，TPAT-DNN对细菌膜的锚定能力优于对细菌膜的锚定能力。 TPAT-DN在相同的孵育条件下。 这些结果表明，TPATs在调节正电荷后对大肠杆菌的细菌膜锚定能力产生了截然不同的影响，我们推测其可能的机制是由于TPATs数量不同，与脂质膜之间的分子间相互作用不同。 他们的头组中的指控。使用扫描电子显微镜（SEM）评估了 TPAT 的 PDT 期间细菌死亡的潜在机制。 如图所示，对照组、仅光组和仅 TPAT 组中的所有细菌细胞均完整且光滑。 相比之下，TPAT-DN和TPAT-DNN联合光照射均引起大肠杆菌和金黄色葡萄球菌明显的膜损伤和形态崩溃。
利用两种TPATs优异的抗菌性能，进一步评价了这两种TPATs对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)和耐碳青霉烯类大肠杆菌(CREC)的光动力抗菌效果。对于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，TPAT-DN和TPATDNN在有效浓度为2μm时显示出相似的抗菌活性，与对无耐药性的金黄色葡萄球菌的抗菌活性相似。值得注意的是，2个μM TPAT在30 mW cm−2白光照射30分钟后杀死了99.5%的MRSA细胞。此外，CLSM和SEM图像验证了TPATs对MRSA的膜锚定行为和抗菌机理与对金黄色葡萄球菌的相似。接下来，对TPATs对CREC的抗菌活性进行了类似的评价。在30 mW cmμ−2白光照射下，8 mTPAT-dN对CREC细胞的杀伤率约为97%。然而，在相同浓度的TPAT-DNN中，只有23%的CREC可以被TPAT-DNN的PDT有效地杀死。CLSM和SEM的详细研究表明，TPAT-DNN和TPAT-DN在CREC上具有相似的膜锚定行为。这些结果表明，TPATs的PDT对耐药菌MRSA和CREC具有充分而有效的抗菌作用，其中TPAT-DNN具有6个正电荷，是一种低浓度的高效MRSA特异性抗菌剂。正如预期的那样，白光照射对MRSA和CREC的生长几乎没有影响。此外，在TPATs用光照射处理后，MRSA细菌中也显示出有效的RoS产生。进一步测试了TPATs在低氧条件下的抗菌性能，发现TPAT-DNN在低氧条件下对MRSA的光动力抗菌效果好于TPAT-DN(。造成这种差异的一个重要原因可能是TPAT-DNN和MRSA细菌之间的强烈相互作用可能是主要原因。
由于TPAT-DNN对多重耐药菌MRSA具有高效的体外细菌杀灭活性，我们进一步发现TPAT-DNN可以彻底杀灭MRSA，而在相同条件下TPAT-DN处理仍有少量残留细菌 ，即使在不同的稀释比例下。 进一步评估了 TPAT-DNN 对 MRSA 感染伤口小鼠模型的体内抗感染性能。 经过两次5μm TPAT-DNN治疗加30分钟白光照射后，MRSA感染伤口区域表现出高效的抗感染能力，并在9天治疗结束时实现了80％的伤口愈合。 相比之下，仅光照射组和仅TPAT-DNN组的伤口愈合率分别约为30%和60%，与对照组（27%）相比略有增加。 这些结果证明了 TPAT-DNN 在体内 MRSA 感染伤口愈合方面的高效性。 此外，治疗9天后，通过苏木精和伊红（H&E）、Masson三色染色以及TNF-��（绿色）、IL-6（绿色）免疫荧光染色评估TPAT-DNN对皮肤组织切片的创面修复效果。如图所示，在 TPATDNN+L 组的 H&E 图像上可以清楚地观察到完整的表皮和毛囊，并且与对照组略有不同。 Masson三色染色进一步揭示了伤口愈合细节，结果表明TPATDNN联合光照射有利于增强伤口内胶原纤维沉积，从而进一步促进伤口愈合。 与其他组相比，TPAT-DNN+L 组的两种炎症因子 TNF-α 和 IL-6 显着减少。
总结
我们报道了星形近红外发射PSS的正电荷的调节，以促进自由基的产生，并证明了它们在愈合感染多药耐药细菌的伤口方面的有效性。在正电荷调节下，具有6个正电荷的TPAT-DNN只通过I型途径促进·OH的产生，而具有3个正电荷的TPAT-DNN则有效地产生1O2和O2·−。TPAT-DNN和TPAT-DNN在较低浓度下均能有效杀灭大肠杆菌和金黄色葡萄球菌。然而，对于多重耐药菌，TPAT-DNN的PDT效应在低浓度和低氧条件下对MRSA细菌的杀灭效果尤其明显，而对CERC细菌的杀灭效果较差。体内实验进一步证明，TPAT-DNN可以特异性地根除MRSA感染，加速伤口愈合过程，具有良好的生物安全性。因此，本工作仅使用了一种简单的合成途径来调节光敏剂的电荷，并有效地调节了ROS的产生类型，在此策略下，I型光敏剂TPAT-DNN即使在低氧条件下也能达到对MRSA细菌的高效杀菌效果。
参考文献
Charge Engineering of Star-Shaped Organic Photosensitizers Enables Efficient Type-I Radicals for Photodynamic Therapy of Multidrug-Resistant Bacterial Infection， Jie Yu, Wenchang Xu, Huan Chen, Haitao Yuan,* Yu Wang, Xiandie Qian, Jie Zhang,Yu Ji,Qi Zhao,* and Shengliang Li，Adv. Healthcare Mater. 2024, 2402615，https://doi.org/10.1002/adhm.202402615
