内容提要
次氯酸（HOCl）被证实是阿尔茨海默病（AD）一种可靠的生物标志物。本研究报道了一种j聚集诱导的有机荧光点（PBT dots），它是由新设计的有机分子PBT与聚合物DSPE-PEG共组装而成的，用于在AD小鼠的活脑源性内皮细胞（bEnd.3）和脑组织中进行ClO -成像。所制备的双光子PBT点具有715 nm的近红外发射、245 nm的大斯托克斯位移、2s内的快速响应、比例传感特性和良好的血脑屏障穿透能力，PBT点有望作为了解和揭示AD病理的成像探针。
PBT的合成及其ClO−响应
本研究在制备有机发射点之前，首先以吩噻嗪为电子给体和ClO -捕获单元，苯并噻唑为电子受体，构建了ClO -敏感的D-A-D探针（PBT）。以4,7-二（4,4,5,5-四甲基1,3,2-二恶波罗兰-2-基）苯并[c][1,2,5]噻二唑和3-溴-10 -甲基- 10h -吩噻嗪为原料，采用Suzuki反应合成PBT染料。研究了PBT对ClO−反应的机理。在ClO−存在的情况下，PBT的苯噻嗪组分中的硫醚可以被ClO−特异性氧化成一个吸电子单元，即亚砜结构。利用密度泛函数理论（DFT）分别计算了PBT与ClO−反应前后的最高已占据分子轨道（HOMO）和最低未占据分子轨道（LUMO）的能级。如图所示，PBT的HOMO轨道主要分布在吩噻嗪单元部分，而PBT的LUMO轨道主要分布在苯并噻唑单元部分。PBT从HOMO到LUMO跃迁的能隙为0.047 eV。相应地，电子云的分布呈现出从吩噻嗪环向苯并噻二唑单元移动的趋势，表现出明显的光诱导分子内电荷转移（ICT）过程的特征然而，当探针PBT与ClO−反应时，吩噻嘧啶中的硫醚结构向亚砜结构的转化产生了比PBT更大的能隙，计算出HOMO - LUMO能隙为0.061 eV，导致光谱蓝移。
PBT在PBT点中的聚集行为
疏水有机分子荧光团通常可以共组装形成纳米颗粒（NPs）结构，具有良好的水分散性，以提高其胶体稳定性、生物相容性和体内循环时间。本研究采用纳米共沉淀法，将PBT分子与生物相容性聚合物二硬脂酰磷酸乙醇胺-聚乙二醇（dpe - peg）共组装，构建荧光纳米颗粒（PBT点）。为了获得最佳的传感性能并避免纳米颗粒聚集，优化了PBT与DSPE-PEG的质量浓度比，在PBT点的制备过程中始终采用1:10的质量浓度比。这种聚合物辅助的纳米组件可以提高所得探针的生物相容性和血脑屏障穿透能力。为了研究PBT的聚集行为，首先在二甲基亚砜（DMSO）和甲苯的混合溶剂体系中测量了PBT的紫外-可见吸收光谱和荧光光谱。如图所示，随着DMSO/甲苯混合溶剂中甲苯分数（fT）的增加，PBT的荧光强度逐渐增加。当fT在0 ~ 60%范围内时，PBT几乎处于非发射状态，没有明显的荧光，说明PBT以单体形式存在，且PT转子可以自由旋转。然而，当fT大于70%时，由于聚集体的分子内旋转（RIR）的限制，荧光显著增强，表明PBT具有典型的聚集诱导发射（AIE）特性。我们知道，当荧光小分子聚集时，由于ACQ机制，其荧光发射可能部分或完全淬灭，这在很大程度上限制了其应用。相反，在AIE诱导的纳米颗粒中，AIE点表现出比其单体更强的亮度，使其更有利于生物成像。本研究设计的PBT分子可能为制备AIE点提供一种新的框架结构。
PBT点的表征及其对ClO−的荧光传感性能
利用TEM和DLS技术对制备的PBT点进行表征，结果表明PBT点为直径约为47.8 nm的球形颗粒。PBT点在遮光的环境条件下是稳定的，PBT点的粒径在至少72小时内几乎保持不变。由于覆盖在PBT点表面的DSPE-PEG聚合物的存在，PBT点带负电荷，具有−30.2 mV的zeta电位。图中为PBT点与ClO−反应前后的紫外可见光谱和荧光光谱。如图所示，在激发为470 nm时，PBT点的最大近红外发射峰在715 nm处，表明制备的PBT点具有高达245 nm的斯托克斯位移。大斯托克斯移和近红外发射不仅可以减少生物物质的光谱重叠、自吸收和自荧光的干扰，还可以提高成像信噪比。在ClO−存在的情况下，在590 nm处观察到一个新的荧光峰，表明PBT点与ClO−反应形成新的产物，所提出的PBT点可以作为ClO−传感的探针。计算得到PBT点的量子产率（QY）为43.08%，反应产物的量子产率为47.24%。研究了PBT点的双光子特性。从图中可以看出，PBT点表现为双光子吸收和发射，在最佳双光子激发波长740 nm时，测得双光子吸收截面（TPA）为10586 GM。大的斯托克斯位移，大的TPA截面和高量子产率使PBT点成为一种很好的体内成像探针。
为了研究PBT点的传感特性，采用荧光滴定法。如图所示，随着ClO−浓度的增加，590nm处的荧光强度逐渐显著增强，715nm处的荧光强度逐渐减弱。在50 ~ 200 μm的ClO−浓度范围内，590nm与715nm通道的荧光强度之比（I590/I715）与ClO−浓度呈线性相关。这一结果表明，所提出的PBT点可以作为比例探针用于检测ClO−。值得注意的是，这种自校正比例AIE点作为荧光探针的报道很少。从LOD = 3s k−1计算出PBT点的检出限为115.54 nm，表明PBT点对ClO−具有较高的灵敏度。评估了探针对ClO−的响应时间。由图可以看出，在250 μm ClO−存在下，响应是瞬时的，荧光强度比（I590/I715）在2 s内达到稳定值，比文献报道的响应时间（5、55、30 s等）短得多。[46-49]为了研究PBT点对ClO -检测的特异性，我们分别记录了ClO -和不同潜在干扰物质（如·OH、1O2、H2O2、HSO3−、NO、NO2−、NO3−、ONOO−、t-BuOOH以及GSH和Cys）的荧光响应。如图所示，除ClO−外，上述干扰物质的加入对相对荧光强度的波动可以忽略不计，这说明PBT点对ClO−的感应具有很高的选择性，这是由于PBT分子中ClO−与硫醚单元之间的特异性反应。
活脑源性内皮细胞中ClO−的双光子成像
PBT点在活体弯曲中对ClO−进行双光子成像的能力。细胞3进一步评估。如图所示，PBT点加载bEnd。细胞3红色通道荧光较强，绿色通道荧光较弱，表明这些斑点进入细胞内部，表明内源性ClO−浓度很低。外源20 μm ClO−处理后，对比图中的荧光强度，可以发现由于细胞内ClO−浓度升高，绿色通道的荧光强度显著增强，而红色通道的荧光强度减弱，这与图中的光谱结果一致。这表明PBT点可以捕获细胞中的ClO−，并且可以成功地用作ClO−比例成像的荧光探针。内源性ClO−的体内成像也通过脂多糖（LPS）诱导的内源性ClO−在活的bEnd中进行。如图所示，细胞经LPS处理后，与图中的荧光强度相比，绿色通道的荧光强度明显增加，而红色通道的荧光强度明显降低，说明内源性ClO−在LPS刺激下原位生成。比值通道的亮度可以更清晰地观察到荧光的变化。
AD小鼠脑组织中ClO−的荧光成像
我们进一步将PBT点分别应用于正常小鼠和AD小鼠脑海马的ClO -水平成像。在使用PBT点成像脑组织中的ClO -之前，PBT点通过血脑屏障的穿透能力首先被评估，因为血脑屏障是荧光探针进入脑组织的许多生物屏障中最重要的。为了评估探针PBT点的血脑屏障穿透能力，采用成熟的transwell方法建立体外血脑屏障模型，如图所示。根据计算值，20.41%的PBT点成功穿透模拟血脑屏障，表明PBT点具有满意的血脑屏障穿透和脑靶向能力，可用于脑成像。本研究采用PBT点作为指标，分别测定AD小鼠和正常小鼠海马中的ClO−水平。本实验以10月龄野生型C57BL/6 （wt型）小鼠为对照组，APP/PS1转基因C57BL/6 （tg型）小鼠为AD模型。PBT点通过尾静脉注射到小鼠体内。2 h后解剖脑组织，取海马荧光成像。如图所示，注射PBT点后，wt型和tg型小鼠的红、绿通道均显示出明显的荧光，表明wt型和tg型小鼠海马中均存在ClO−。而tg型小鼠绿色通道的荧光强度明显强于wt型小鼠，红色通道的荧光强度略弱于wt型小鼠，从比值通道可以明显观察到差异。这说明AD小鼠脑内的ClO−浓度高于正常小鼠。这些结果表明PBT点可以作为一种比率成像探针来跟踪脑组织中的ClO -水平。
总结
本研究合成了具有j聚集行为的ClO−响应双光子苯并[c]噻二唑衍生的荧光染料PBT。采用纳米沉淀法将PBT分子与DSPE-PEG共组装得到PBT点。所得到的PBT点表现出优异的抗猝灭性和对ClO−的快速响应，而无需引入新的荧光物质作为参考。PBT点不仅具有245 nm的大stokes位移，而且具有明亮的近红外发射，能够通过血脑屏障瞬时捕获小鼠脑中的ClO−。
参考文献
Near-Infrared Two-Photon J-Aggregation-Induced Organic Fluorescent Dots with Large Stokes-Shift for Ratiometric Imaging of Hypochlorous Acid in Living Cells and Brains of AD Mice,Rui Huang, Ziwei Zhang, Zhen Shi, Yumeng Yang, Junyong Sun, and Feng Gao,Adv. Healthcare Mater. 2024, 2402779,https://doi.org/10.1002/adhm.202402779
