内容提要
本文提出了一种新的分子设计策略来构建一个近红外RNA特异性荧光探针（HQBT），用于跟踪活细胞中的SGs。带正电的探针HQBT是针对RNA的负槽设计的，通过调整分子中氮原子的位置，显著提高了其与RNA的结合亲和力。引入一个额外的羟基来实现近红外发射，增强RNA结合能力。HQBT可以在5 s内快速染色活细胞中的RNA，在光稳定性和选择性方面优于SYTO RNA- select染料。
实验结果与讨论
为了监测细胞内RNA，我们以苯并噻唑盐为基质，设计并合成了一系列D-π-A构型的分子探针。首先，苯并噻唑和喹啉部分是许多生物分子的母体，因此有助于探针的生物相容性。其次，苯并噻唑盐带正电，因此能够更好地与带负电的RNA磷酸主链结合。第三，暴露在喹啉基团上的N原子容易与RNA形成分子间氢键，从而增强了探针与RNA的结合能力。最终，喹啉部分羟基的引入不仅增强了分子内电荷转移（ICT），使探针的发射红移到近红外区域，而且还提供了一个与RNA结合的氢键位点。与化合物1和2相比，HQBT探针的吸收光谱和荧光发射分别显示出从370到570 nm，这三种探针最初显示出非常弱的荧光。添加RNA后，化合物1的吸光度和发射度没有明显变化。相比之下，化合物2改变了喹啉氮的位置，加入RNA后其荧光强度增强了7.9倍，但其荧光发射峰在480 nm处，不利于生物成像应用。在喹啉8的位置进一步引入羟基，得到以化合物2为基础的探针HQBT。HQBT在RNA的作用下荧光增强了33倍，发射峰红移至605 nm，说明HQBT对RNA具有较强的结合能力，近红外发射使其在生物成像领域有更好的应用前景。
我们研究了HQBT对溶液中RNA的选择性反应能力。添加5 μg/mL的RNA溶液，HQBT的荧光也显著增强（红线），当RNA浓度达到1 mg/mL时，探针的荧光强度增强了33倍。HQBT的荧光比（I/I0）与RNA浓度呈良好的线性关系（R2 = 0.998），计算出HQBT对RNA的检出限为0.78 μg/ mL。相比之下，在相同条件下，探针的荧光强度在1 mg/mL DNA溶液中仅增加6倍。有趣的是，当等量的DNA逐渐加入到RNAsaturated的HQBT溶液中时，溶液的荧光强度几乎保持不变，而当等量的RNA加入到DNA饱和的HQBT溶液中时，荧光强度明显增加。HQBT的选择性响应和抗干扰研究表明，各种阴离子、阳离子、氨基酸、活性氧和活性硫对发射过程没有显著影响。这进一步证实了HQBT在复杂生物环境中用于跟踪RNA动力学的潜力。
我们使用HQBT对活细胞进行荧光成像。HQBT可以在5 s内快速进入活细胞，并发出亮红色荧光（Ex: 561 nm, Em: 590 ~ 650 nm）照亮细胞，表明HQBT比SYTO RNA-Select具有更快的荧光响应，用市售RNA染料（SYTO RNA- select）进行共定位实验，证实HQBT与RNA结合（Pearson’s系数0.88）。值得注意的是，商业染料SYTO RNA- select主要标记细胞内RNA，但它也部分染色细胞核内的DNA。相比之下，HQBT对RNA具有更好的选择性。这种差异可能是由于HQBT从RNA中取代了SYTO RNA- select，导致SYTO随后与细胞核中的DNA结合。为了进一步研究这一点，我们用HQBT和SYTO RNA-Select进行了竞争实验。如图所示，将SYTO RNA- select加入到含有过量RNase的RNA溶液中，经过DNase处理后，HQBT在605 nm处的荧光强度基本保持不变，荧光强度无明显变化，这强烈表明HQBT在活细胞中与RNA的结合是可靠的。最有趣的观察结果是，经过RNase处理后，HQBT的荧光强度比SYTO RNASelect的荧光强度下降更明显，这表明HQBT比SYTO对RNA的选择性更强。细胞摄取实验表明，与对照组相比，4°C、氯丙嗪、秋水仙碱、2-脱氧葡萄糖和NH4Cl处理后Hep G2细胞的荧光强度没有改变。这表明HQBT通过自由扩散迅速内化到细胞中。此外，HQBT还分别培养了三种人类细胞，包括癌细胞（HeLa和SY5Y）和正常细胞（QSG）。如图所示，所有细胞都显示出可识别的红色荧光，证实了HQBT用于RNA成像的通用性。
鉴于HQBT具有良好的光稳定性，低细胞毒性和近红外辐射，我们有动力探索HQBT监测SGs的潜力。研究表明，NaAsO2可以诱导细胞氧化应激，从而导致SGs的产生。不同时间NaAsO2诱导Hep G2细胞后，用5 μM HQBT孵育3 min，共聚焦显微镜下成像。单独用HQBT孵育的细胞处于正常状态，未形成颗粒状RNA聚集体。NaAsO2作用20和60 min后，Hep G2细胞细胞质中出现小点。此外，诱导60分钟的Hep G2细胞比诱导20分钟的Hep G2细胞产生更多的斑点，并且更大。正如文献所述，G3BP1是控制SGs组装和拆卸的核心蛋白。因此，为了验证颗粒状RNA聚集体确实是SGs，我们使用绿色荧光蛋白标记的G3BP1 （GFPG3BP1）作为SG蛋白标记物，与HQBT进行共定位实验。值得注意的是，10分钟产生的小点和30分钟产生的大点与GFP-G3BP1的点高度重叠，这表明HQBT对氧化应激早期产生的小SGs和成熟的大SGs都有很好的成像能力。有趣的是，我们还观察到单独的G3BP1蛋白颗粒和单独的RNA颗粒，这可能表明除了蛋白质- RNA相互作用外，蛋白质-蛋白质和RNA - RNA相互作用也参与了SG的组装。重要的是，无论SG的大小，蛋白质和RNA共存的合并区（黄色）位于SG的核心，这与报道的SGs的核-壳模型一致，SGs包含稳定的核心亚结构，周围是凝胶状RNA相分离的壳，其中外部RNA之间的弱相互作用力促进了它们与细胞质中自由mrna的交换。
总结
我们成功地开发了一种新的分子组装策略，用于RNA标记和活细胞中SGs的动态成像。该策略依赖于前体的精细设计和筛选，包括调整吡啶氮的位置和引入羟基，从而使HQBT具有优越的RNA选择性和近红外发射能力。HQBT结合RNA后荧光强度增强33倍，具有高光稳定性、小尺寸、优良的生物相容性等特点，能快速、无洗涤、选择性、高成像分辨率地“点亮”活细胞中的RNA相关区域，是研究RNA相关生物学（如SG组装和拆卸过程）的理想工具。
参考文献
Engineering a Novel NIR RNA-Specific Probe for Tracking Stress Granule Dynamics in Living Cells,Dong Wang,* Wei Huang, Yaping Zhu, Zhiwen Yu, Yafei Zhou, Yinyin Chen, Zhihui Feng,* Xiaohe Tian, Guangmei Han,* and Zhongping Zhang,Anal. Chem.,https://doi.org/10.1021/acs.analchem.4c05782
