内容提要
本研究提出了一种缺氧启动的超分子自由基系统，能够诱导细胞内聚合，从而破坏4T1细胞内的细胞骨架和细胞器。该系统利用一种2:1的超分子主-客体复合物，由CB[7]和苝酰二亚胺衍生物（PDI）组成，称为PDI+2CB[7]，该复合物被肿瘤的缺氧和还原环境选择性地还原，产生离域自由基阴离子。CB[7]有效地稳定了这些阴离子，使PDI+2CB[7]复合物在4T1细胞内与2-羟乙基甲基丙烯酸酯（HEMA）引发自由基聚合。由此产生的原位聚合显著破坏肿瘤代谢，导致强烈的抗肿瘤反应而没有全身毒性。
为了在生物还原环境下制备自由基发生器，首先通过3,4,9,10-苝四羧基二酐与N，N-二甲基-1,2-乙二胺的连续醛胺缩合反应和所得到的2,9双（3-（二甲氨基）丙基）炭黑[2,1,9-def:6,5,10-d ' ' f ']二异喹啉-1,3,8,10(2H,9H)-四酮与4-乙烯基氯化苄的卤化反应合成了PDI。随后，在5.3 ~ 6.7 ppm之间的三个双峰表明PDI结构的末端双键被成功修饰。由于存在苯环基团和邻近的铵，CB[7]与PDI结合。
为了验证还原环境下自由基阴离子的生成，选择二亚硫酸钠（Na2S2O4）（硼酸盐缓冲液，pH = 8）模拟体外还原环境。将新制备的Na2S2O4溶液加入带盖的EP管中，搅拌3min后，PDI+2CB[7]溶液明显由红色变为蓝色，表明PDI自由基可能形成。此外，紫外-可见光谱显示，加入Na2S2O4后，PDI和PDI+2CB b[7]在495和543 nm处的特征吸收峰强度下降，分别在734和818 nm处的吸光度增加。这些结果表明，PDI和PDI +2CB[7]溶液都可以产生自由基阴离子，以响应还原环境。利用电子顺磁共振（EPR）谱分析了PDI+2CB[7]的生物还原过程。如图所示，在低氧条件下，肿瘤细胞（小鼠乳腺癌细胞、4T1细胞）存在时，可以清晰地观察到g因子为2.0045的EPR信号，而在常氧条件下，非癌细胞（人永生化表皮细胞、HaCat细胞）存在时，则没有典型的EPR信号，证实了超分子自由基阴离子的形成是对生物还原环境的响应。缺氧环境下培养的4T1细胞经PDI+2CB[7]处理后，在818 nm处出现超分子自由基阴离子的特征吸收带。而在常氧条件下，HaCat细胞中没有观察到自由基阴离子的紫外-可见吸收信号。
由于交联自由基聚合反应，在缺氧环境下，具有碳-碳双键的HEMA在PDI +2CB[7]配合物存在下显示出聚合的潜力。随着Na2S2O4的加入，PDI+HEMA在还原条件下由于自由基阴离子的形成，荧光完全消失。随着时间的延长，观察到微弱的荧光，这可能是由于自由基引起的聚合反应的发生。值得注意的是，当体系中加入CB[7]时，PDI+HEMA的荧光强度显著增强了1.7倍，这是由于超分子络合作用削弱了游离PDI的π−π堆叠。从而显著提高了自由基生成和聚合反应的速度和程度。这与之前的报道一致，CB[7]可以削弱苝二亚胺的紧密堆积，抑制苝二亚胺自由基阴离子的二聚化和猝灭，最终提高水溶液中自由基的产率。同时，扫描电镜（SEM）成像显示，PDI+2CB[7]+HEMA在还原环境下由块状物质形成明显的微尺度纤维聚合物，而PDI+HEMA只能形成纳米尺度的纤维聚合物，进一步说明了CB[7]在还原环境驱动下促进自由基聚合的重要性。当PDI+2CB[7]+HEMA的浓度增加到毫摩尔水平时，孵育4小时后甚至可以观察到水凝胶的形成，而PDI+2CB[7]、HEMA或Na2S2O4的混合物不能诱导凝胶形成过程。
在还原条件下展示了PDI+2CB[7]+HEMA自由基增强聚合后，进一步研究了其在生活环境下生物聚合的可能性。共孵育3 ~ 4 h后，4T1细胞的荧光强度变化最大，基本保持不变，提示细胞内聚合可能完成。因此，在后续的细胞实验中，我们选择孵育时间为4 h。4T1细胞分别用PDI、PDI+2CB[7]、PDI+HEMA、PDI+2CB[7]+HEMA在缺氧环境下孵育。正常环境下培养的HaCat细胞作为对照组。从共聚焦图像和流式细胞术结果来看，与PDI或PDI+HEMA处理相比，PDI+2CB[7]孵育后的4T1和HaCat细胞的红色荧光更强。这主要是由于CB[7]的络合作用削弱了PDI分子的聚集，从而使两种细胞的荧光强度增加到约1.6倍。
同时，这两种细胞系在其他组的荧光发射行为也发生了不同的变化。4T1细胞中出现了较大的荧光发射簇，这是由于4T1细胞内发生了聚合反应，消耗了部分PDI，产生了超分子聚合物。PDI+2CB[7]+HEMA的荧光强度略弱于PDI+2CB[7]，而HaCat细胞的荧光强度基本相同。此外，生物透射电镜（Bio-TEM）可以直观地观察细胞内聚合的发生。缺氧环境下PDI+2CB[7]+HEMA培养的4T1细胞内观察到明显的纤维物质。相比之下，PDI+2CB[7]+HEMA处理的HaCat细胞没有可见的聚合物纤维。这些结果表明，PDI +2CB[7]+HEMA可以在缺氧环境下选择性地诱导4T1细胞的生物聚合。这种细胞内聚合的链终止过程主要是由于自由基的猝灭和PDI的消耗。由于自由基在细胞内迅速被淬灭，因此引入CB[7]可以在一定程度上延长自由基的寿命，增加自由基的产量；然而，在复杂的胞质微环境中，仍然无法避免自由基的最终猝灭。此外，PDI末端的不饱和键参与了聚合过程，PDI的消耗导致聚合反应结束。随着孵育时间的增加，4T1细胞的形态逐渐发生变化，表明4T1细胞内形成的聚合纤维有可能影响其正常生理功能。然而，HaCat细胞在较长时间内仍保持形态完整。因此，研究了细胞内聚合反应对细胞活力的影响。与PDI、PDI+2CB[7]或HEMA单独处理的细胞相比，在缺氧环境中分别用PDI+HEMA和PDI+2CB[7]+HEMA孵育的4T1细胞显示出明显的细胞死亡，这表明PDI+HEMA或PDI+2CB[7]+HEMA的细胞内聚合引起细胞损伤。同时，PDI+2CB[7]+HEMA诱导的细胞死亡比PDI+HEMA诱导的细胞死亡更强，这是由于加入CB[7]后聚合得到改善。同时，HaCat细胞不受PDI+HEMA或PDI+ 2CB[7]+HEMA影响。同样，Calcein AM/ pi染色4T1细胞的共聚焦图像显示，PDI+HEMA或PDI+2CB[7]+HEMA培养的4T1细胞明显死亡，并且对4T1细胞的凋亡也有浓度依赖效应。当4T1细胞分别用低浓度的PDI+HEMA和PDI+2CB[7]+HEMA处理时，它们的内化浓度很低，导致细胞活力差异很小。随着浓度的增加，PDI+HEMA诱导4T1细胞的死亡程度更高，且PDI+HEMA与PDI+ 2CB[7]+HEMA处理的4T1细胞活力差异更大，且均表现出剂量依赖性。提示c[7]络合作用参与了PDI +HEMA抑制肿瘤生长的作用。实际上，细胞内聚合策略主要依赖于PDI形成的自由基阴离子的起始。由于自由基阴离子极其敏感，在细胞内复杂的微环境中会被迅速猝灭，因此CB[7]的引入可以显著降低PDI分子的LUMO和HOMO能，削弱PDI芳核的紧密堆积，抑制PDI自由基阴离子的二聚化和猝灭，从而提高水溶液中自由基的产率。
用2′，7′二氯双氢荧光素（H2DCFDA）表示活性氧（ROS）的产生，通过共聚焦成像和流式细胞术检测，所有经PDI、PDI+2CB[7]和HEMA处理的4T1细胞均显示低绿色荧光强度。相比之下，PDI+HEMA和PDI+2CB[7]+HEMA处理的4T1细胞荧光强度增加，表明ROS水平较高。此外，定量分析显示，PDI+2CB[7]+HEMA处理的4T1细胞中ROS含量比PDI+ HEMA处理的细胞高1.25倍，表明细胞内超分子自由基介导的聚合诱导了ROS过量产生。采用JC-1试剂盒检测不同处理后4T1细胞线粒体膜电位（MMP）。如图所示，PDI+2CB[7]+ hema处理的细胞中，JC1单体的绿色荧光明显增强，而JC1聚集的红色荧光减弱，表明细胞MMP水平明显降低。分别用PDI、PDI+ 2CB[7]、HEMA和PDI+HEMA处理的4T1细胞的MMP变化可以忽略不计，与PBS组相当。流式细胞术分析进一步证实，PDI+2CB[7]+HEMA处理显著降低了MMP，其中JC1单体占多数。此外，PDI+2CB[7]+HEMA处理的4T1细胞显示出高的早期凋亡率和抑制ATP的产生，并且总是伴随着MMP的降低。与其他处理组相比，PDI +2CB[7]+ hema处理的4T1细胞线粒体（红色）和细胞色素c（绿色）之间的荧光共定位强度降低，显示线粒体细胞色素c渗漏和线粒体损伤。
本实验以BALB/c小鼠右后腿皮下注射106个4T1细胞，给药8天后建立皮下肿瘤模型。将荷瘤小鼠随机分为3组（n = 12），分别以25.0 μM剂量给药PDI+HEMA和PDI+2CB[7]+HEMA。在给药后的不同时间点（2、12、24、48 h）采集心、肝、脾、肺、肾进行离体荧光成像。在整个实验期间（长达48 h）， PDI+2CB[7]+ hema处理的小鼠在肿瘤中保持高水平的荧光强度，持续强于其他器官，表现出较强的肿瘤滞留性。这一结果应归因于响应缺氧肿瘤微环境的超分子自由基介导的细胞内聚合。然而，PDI+ hema处理小鼠肿瘤组织的荧光强度迅速下降，肝脏和肾脏的荧光强度逐渐增加，说明CB[7]的加入增强了肿瘤组织的聚合效率，延长了肿瘤滞留时间。这种现象是有益的，因为PDI和CB[7]之间的超分子络合增强并稳定了自由基的产生，从而促进了肿瘤组织中的聚合。实验结束时，对小鼠实施安乐死，切除肿瘤进行切片和荧光成像。与PDI+ HEMA处理的小鼠（26.4%）相比，PDI+2CB[7]+HEMA处理的小鼠整个切片显示59.8%的红色荧光区域。
放大后的荧光图像准确地证实了荧光信号位于4T1细胞的细胞质中，进一步证实了PDI+2CB b[7]+HEMA的高肿瘤保留效应归因于4T1细胞内还原和缺氧微环境引发的细胞内聚合。此外，为了直接证明4T1细胞中聚合反应的发生，我们对PDI +2CB[7]+ hema处理小鼠的肿瘤切片进行了生物透射电镜分析。与未处理小鼠相比，细胞质中明显可见大量聚合物纤维材料，表明肿瘤组织中细胞内聚合物的形成。聚合物形态较更为明显，可能是由于PDI +2CB[7]+HEMA处理浓度较高所致。
针对细胞内聚合引起的细胞损伤和细胞死亡，研究了PDI +2CB[7]+HEMA的抗肿瘤作用。BALB/c小鼠右后腿皮下注射荧光素酶4T1细胞100 μL(107个/mL)，建立荧光肿瘤模型，给药途径、给药剂量、给药时间如图所示。通过IVIS光谱成像的生物发光监测肿瘤负荷，并计数。这些结果表明，1、2剂量PDI +2CB[7]+HEMA在给药初期对小鼠的肿瘤生长有明显抑制作用，但肿瘤又迅速生长。然而，三次剂量治疗后，三分之一的小鼠完全清除了肿瘤。这一结果表明，在肿瘤组织中启动的细胞内聚合提供了一种非药物和精确的抗肿瘤策略。
我们开发了一种利用内源性细胞刺激在肿瘤细胞内诱导原位自由基聚合的方法，从而形成持久的聚合物，在小鼠皮下肿瘤模型中表现出治疗效果。肿瘤细胞以明显的缺氧为特征，积累高水平的还原性物质，引发PDI+2CB[7]超分子自由基的形成。这些自由基引发与HEMA的聚合反应，在肿瘤细胞内产生大量聚合物沉积。这些聚合物的长期存在有效地抑制细胞生长并诱导细胞凋亡。
参考文献
Hypoxia-Initiated Supramolecular Free Radicals Induce Intracellular Polymerization for Precision Tumor Therapy,Mian Tang, Zhiqing Yang, Xingchen Tang, He Ma, Beibei Xie, Jiang-Fei Xu, Cheng Gao,* David Bardelang, and Ruibing Wang*,J. Am. Chem. Soc.,https://doi.org/10.1021/jacs.4c14847
