本文报道2-吡啶基二硫化物荧光探针（WSP1、WSP2、WSP3、WSP4和WSP5）的设计、合成、性能及其在细胞成像中的应用。该策略是基于硫化氢的双亲核性。硫化氢介导的串联亲核取代环化反应用于释放荧光团并开启荧光。该探针对硫化氢的敏感性和选择性高于其他活性硫，包括半胱氨酸和谷胱甘肽。
探头的设计与合成
H2S在生物体系中是一种反应性亲核试剂，容易发生亲核取代或加成反应。要从生物硫醇池中选择性检测H2S，关键是将H2S与其他生物硫醇（如半胱氨酸（Cys）和谷胱甘肽（GSH））区分开来。H2S为非取代硫醇，可发生两次亲核反应；其他的硫醇如Cys和GSH是单取代的硫醇，只能进行一次亲核反应。基于这一性质，我们认为含有双亲电中心的化合物是检测H2S的有用试剂。H2S应与探针A最亲电的组分反应，生成含有中间体B1的游离SH。如果在合适的位置存在另一个亲电反应中心，如B1所示的酯基，则SH基团应进行自发环化以释放荧光团并形成产物P。这种策略不仅可以捕获H2S作为稳定的可分析的产物P，而且可以通过方便和敏感的荧光测量来可视化H2S信号。值得注意的是，底物A也可能与生物硫醇（RSH）发生反应。然而，产物B2不应进行环化以释放荧光团。此外，如果使用适当的亲电试剂，则与生物硫醇的第一次反应可能是可逆的或非生产性的，因此探针不会被生物硫醇消耗。我们首先制备了一种模型化合物1，并尝试与H2S反应(在缓冲体系中使用NaHS作为等效物）。在这个模型化合物中，我们设想2,2 ' -二吡啶二硫是一种有效的亲电试剂，可以捕获H2S，苯是一种合适的连接剂。苯1,2取代的刚性应有利于分子内环化。反应进行得很顺利，以83%的收率得到了所需的环化产物2和苯酚。
我们合成了一系列探针。常见的中间体2-（2吡啶基二硫代）苯甲酸3很容易由2-巯基苯甲酸和2,2 ' -二吡啶基二硫混合二硫生成。然后将化合物3与含oh的荧光团偶联，得到WSP - 1 - 5 （WSP=Washington State探针）。我们选择了甲氧基荧光素、7-羟基香豆素、间苯二酚和2-甲基东京绿作为荧光团，因为它们易于获得，具有优异的荧光特性，并且易于被羟基取代而荧光猝灭。对于WSP5，在荧光素的核心结构中引入了两个反应中心。与H2S反应后，应产生高荧光物质。
探针WSP1-5对H2S的荧光特性及响应
我们测试了它们的荧光特性。由于荧光团的羟基发生酯化，这些探针表现出非常弱的荧光，量子产率很低。本研究以WSP1为代表种。当溶液中存在H2S时，WSP1的荧光强度急剧增加。我们也发现媒体在这个过程中扮演着重要的角色。当使用混合CH3CN/PBS缓冲液（10 mM, pH 7.4, 1:1, v/v）溶液时（由于探针的水溶性较差），荧光开启速率稍慢。强度在30min左右达到最大，增加了36倍。而在检测体系中加入少量表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）后，检测体系的开启率显著提高，荧光强度也显著增强（110倍）。WSP2、WSP3、WSP4和WSP5对H2S的荧光开启速度都比较快，通常荧光信号在几分钟内就能达到稳态；WSP2、WSP3、WSP4和WSP5的强度分别增加了275倍、68倍、20倍和60倍。这对于H2S的快速检测是非常有利的。随着H2S的逐渐引入，探针最大发射波长处的荧光强度急剧增加。探针最大发射波长处的荧光强度与不同硫化氢浓度之间具有良好的线性关系。WSP1、WSP2、WSP3、WSP4和WSP5的检出限分别为60、79、47、266和47 nM。
我们研究了探针对H2S的选择性，这是证明探针有效性的最重要的性质。在优化条件下，每个探针（10 mm）分别用不同的活性硫物质处理，包括Cys、GSH、Hcy、SO32-、S2O32-（均为200 mM），混合5分钟后记录荧光信号。这些含硫物质没有引起任何明显的荧光响应，而NaHS （50 mM）对所有探针都有很强的信号。因此，所有探针对H2S的选择性都优于其他活性硫，包括Cys和GSH。
活细胞成像研究
将新鲜培养的HeLa细胞与探针WSP4孵育30分钟，然后用培养基缓冲液洗涤细胞以去除多余的探针，并用不同浓度的NaHS处理。如图所示，当NaHS不存在时，我们在细胞中没有观察到明显的荧光。NaHS作用30min后，细胞出现较强的荧光。60 mm NaHS处理的细胞荧光明显强于30 mm NaHS处理的细胞。用同样的方法对WSP5也进行了测试，观察到相似的结果。因此，我们认为这些探针可以用于活细胞中H2S的检测。
总结
我们在这项研究中提出了一系列基于亲核取代环化的H2S荧光探针的发展。制备5个探针（WSP1-WSP5）并进行评价。这些探针对H2S的选择性优于其他含硫物质，包括Cys和GSH。此外，荧光的“开启”速度很快，在水溶液和细胞成像中证明了这些探针的效率。
参考文献
Fluorescent Probes Based on Nucleophilic Substitution– Cyclization for Hydrogen Sulfide Detection and Bioimaging,Bo Peng, Wei Chen, Chunrong Liu, Ethan W. Rosser, Armando Pacheco,Yu Zhao, Hector C. Aguilar, and Ming Xian*,Chem. Eur. J. 2014, 20, 1010 – 1016,https://DOI: 10.1002/chem.201303757
