内容提要
本文合成了2-[6-（4-羟基）苯氧基- 3h -黄原烯-3- 9-基]苯甲酸（HPF）和2[6-（4-氨基）苯氧基- 3h -黄原烯-3- 9-基]苯甲酸（APF）新型荧光探针，用于选择性检测高活性氧（hROS）。HPF和APF本身几乎不发出荧光，但APF选择性地和剂量依赖性地在与hROS和次氯酸盐（ClO-）反应时提供强荧光化合物荧光素。HPF仅与hROS反应时提供荧光素。因此，hROS可以与过氧化氢（H2O2）、一氧化氮（NO）和超氧化物（O2×-）区分。ClO-也可以通过同时使用HPF和APF来专门检测。
结果与讨论
利用荧光素的荧光可以被荧光素6位的酚羟基用富电子芳香环保护而猝灭，我们设计合成了两种新型的hROS荧光探针HPF和APF。首先，我们研究了HPF和APF对化学生成的hROS的反应性。我们尝试使用HPF和APF检测芬顿反应中形成的hROS之一 。在HPF和APF缓冲液中加入H2O2，再加入高氯酸亚铁。单独加入H2O2后，荧光强度没有增加，但在H2O2存在的情况下，加入高氯酸亚铁后，荧光强度明显增加。HPF和APF都可以选择性地检测 OH。我们检测了Fenton反应中高氯酸亚铁浓度与荧光增强之间的关系。将不同浓度的高氯酸亚铁加入到含有过量H2O2的HPF和APF缓冲溶液中。荧光增强与高氯酸亚铁浓度成正比。HPF和APF都可以检测到芬顿反应中形成的 OH，荧光增加呈剂量依赖性。
我们研究了HPF和APF与ClO-的反应性。添加ClO-后，APF的荧光强度大大增加，而HPF则没有。APF的荧光增强呈剂量依赖性。我们可以同时使用HPF和APF选择性地检测ClO-。
我们研究了在荧光显微镜中用于激发的实际条件下是否会发生光诱导自氧化。我们将HPF或DCFH-DA加载到HLE细胞中，并将负载染料的细胞照射10 s。自氧化产物荧光素和二氯荧光素在缓冲液（pH 7.3）中形成离子，因此倾向于留在细胞内培养基中。结果如图所示。HPF能穿透细胞膜进入细胞内部。在荧光显微镜实际用于激发的条件下，DCFH比HPF更容易在细胞中被光照射氧化。
HPF和APF在酶促系统中的应用我们研究了HPF和APF能否检测酶促系统（即HRP/H2O2系统）中产生的hROS。将H2O2加入到含有HRP的HPF和APF缓冲液中。加入H2O2后，荧光强度立即增强。此外，我们发现HPF和APF可以检测HRP/H2O2系统中产生的hROS，并呈剂量依赖性。HPF和APF可以作为辣根过氧化物酶的底物，并且HPF和APF不仅可以在化学系统中检测hROS，而且可以在酶系统中以剂量依赖的方式检测hROS。
我们将HPF和APF应用于MPO/H2O2/Cl-体系。在Cl-存在的情况下，ClO-主要通过反应中间体化合物产生。APF在该体系中表现出剂量依赖性的荧光增强，而HPF则没有荧光。这些结果与HPF和APF对ClO-的反应性相吻合。因此，我们成功地可视化了MPO/H2O2/ Cl-体系中ClO-的生成。
总结
我们已经成功地开发了新的抗自氧化荧光探针HPF和APF，可以可靠地检测hROS和/或ClO-选择性。通过使用HPF或APF，我们可以区分 OH和NO。单纯产生H2O2对细胞的损伤与在低价金属离子存在下H2O2转化为hROS的情况完全不同，我们觉得探针在这里很有用，因为它们可以区分这两种情况。我们可以选择性地使用HPF和APF一起检测ClO-，因为HPF对OCl没有荧光增强，而APF则显示出剂量依赖性的增强。
参考文献
Development of Novel Fluorescence Probes That Can Reliably Detect Reactive Oxygen Species and Distinguish Specific Species*□,Ken-ichi Setsukinai, Yasuteru Urano, Katsuko Kakinuma, Hideyuki J. Majima, and Tetsuo Nagano, J. Bio. Chem., 2003, 278, 3170-3175
