内容提要
本研究引入了一种聚集诱导发光团（AIEgen）—MeOTFVP，其设计目的是增强神经元追踪和成像效果。MeOTFVP凭借其两亲性融入磷脂双分子层靶向细胞膜。其供体-受体分子骨架促使其光致发光红移至近红外（NIR）光谱区域，显著提高了组织穿透能力。MeOTFVP 对细胞膜的亲和力，加上其深层组织穿透性，使其能够在爪背根神经节（DRG）回路中进行精确追踪，并对坐骨神经进行详细成像。
MeOTFVP 的光物理特性表征
我们开发了一种聚集诱导发光（AIE）分子，命名为 MeOTFVP，它包含一个 π 共轭骨架（疏水部分）和一个季铵盐尾（亲水部分）。MeOTFVP 的两亲性和多个电荷优化了它融入细胞膜的能力 。MeOTFVP 具有典型的供体 - 受体（D-A）分子结构。甲氧基的存在增强了其给电子能力，促进了分子内电荷转移（ICT），从而有助于在更长波长处发射光。在二甲基亚砜（DMSO）稀溶液中，MeOTFVP 在 510nm 处有最大吸收峰，这表明存在强烈的 D-A 相互作用。当在由 DMSO 和甲苯组成的二元溶剂体系中评估时，MeOTFVP 表现出明显的 AIE 特性。随着甲苯比例的增加，MeOTFVP 的最大发射峰从 607nm 红移至 744nm。在含有 5% DMSO 和 95% 甲苯的混合物中，MeOTFVP 的 PL 强度增加了 8 倍以上。这些现象表明形成了纳米聚集体，动态光散射（DLS）测量证实了这一假设。DLS 分析显示，这些纳米聚集体的平均尺寸约为 105.9nm。而且，MeOTFVP 薄膜的发射光与溶液中的发射光有相似的红移，由于其近红外发射特性，适合用于神经元追踪应用。
MeOTFVP 的细胞膜靶向能力
为了验证 MeOTFVP 在活细胞中的细胞膜靶向能力，我们使用 Cell Mask Deep Red 与 MeOTFVP 进行共定位研究。MeOTFVP 在绿色通道中发出的荧光与 Cell Mask Deep Red 在红色通道中的荧光有显著重叠。经计算，绿色和红色荧光通道之间的皮尔逊相关系数（PCC）为 0.88，这表明二者高度共定位，从而证实了 MeOTFVP 对细胞膜具有特异性且生物相容性良好。先前的研究通过分子动力学模拟证明了类似 MeOTFVP 的 AIEgens 能够有效锚定在细胞膜上。MeOTFVP 中双电荷吡啶盐的存在，使其能够通过与细胞膜的亲水成分相互作用，促进对细胞膜的靶向。鉴于 MeOTFVP 卓越的细胞膜靶向特性，它作为神经元示踪剂具有巨大潜力，能够有效地描绘神经元回路。
MeOTFVP 用于外周神经系统的神经元追踪
在我们的研究中，旨在确定 MeOTFVP 作为神经元示踪剂的有效性。为此，我们向小鼠的左爪注射 MeOTFVP 或磷酸盐缓冲液（PBS）,随后，从这些小鼠身上获取 DRG，并通过荧光显微镜进行检查。荧光图像结果显示，当向小鼠左爪注射 MeOTFVP 时，右 DRG 切片中没有荧光信号。相反，在左 DRG 中观察到明显的绿色信号，图像中的白色箭头指示了这些信号。这些信号描绘了 MeOTFVP 对从后爪到腰段 DRG 的神经元投射的追踪。DRG 中的感觉神经元是没有树突的假单极神经元。我们的数据表明，MeOTFVP 可以追踪支配后肢的神经元，其主要定位在神经元胞体而非轴突内。这种分布模式表明，虽然大部分 MeOTFVP 积聚在神经元胞体中，但注射后仍有一部分留在轴突中。此外，注射 PBS 的小鼠的 DRG 没有显示荧光，这突出了不存在非特异性荧光。这些观察结果证实，MeOTFVP 能在外周神经系统中有效地进行神经元追踪，突显了其作为神经科学研究中绘制神经元通路的有力工具的实用性。
受到 MeOTFVP 能进行神经元追踪这一证据的启发，我们使用神经元标记物来验证 MeOTFVP 是否能特异性追踪神经元，而不会标记 DRG 中的其他细胞类型，如巨噬细胞和卫星胶质细胞。红色通道表示 DRG 中的不同细胞类型，而绿色通道表示 MeOTFVP 标记的细胞。白色箭头指向的 MeOTFVP 标记细胞与神经元标记物神经元核（NeuN）部分重叠，这与其他研究报告的结果一致。相反，MeOTFVP 标记的细胞与 DRG 巨噬细胞（Iba1）或 DRG 胶质细胞（GS，谷氨酰胺合成酶）的重叠极少 。此外，与商业神经元示踪剂相比，MeOTFVP 表现出更高的标记率和光稳定性。MeOTFVP 和 DiD 都能追踪 DRG 神经元，但 MeOTFVP 标记了更多投射到后爪的神经元。而且，经过 20 次激光扫描后，注射 DiD 的小鼠的 DRG 荧光信号明显下降了 3%，而注射 MeOTFVP 的小鼠的 DRG 则没有出现这种下降。这表明 MeOTFVP 在连续激光照射下具有更好的光稳定性。这些数据证实，MeOTFVP 能以高标记率和出色的光稳定性特异性追踪投射到后爪的 DRG 神经元。
注射 MeOTFVP 的小鼠坐骨神经活体成像
为了评估 MeOTFVP 在体内的神经成像效果，我们通过活体动物成像系统记录了活体小鼠坐骨神经的荧光信号。与直接给药进行神经可视化不同，我们通过向后爪注射 MeOTFVP 实现了坐骨神经的近红外成像。小鼠的左爪注射 1mM、10μL 的 MeOTFVP，这与之前的神经元追踪实验步骤相似，而对照组则注射 10μL 的 PBS。在活体成像后，从小鼠体内暴露或取出背根神经节（DRG）和神经。图中的彩色图像显示，在模拟临床条件的场景中，暴露的坐骨神经与血液混合，很难识别。随后，在注射 MeOTFVP 或 PBS 后的不同时间点进行荧光成像。在所有时间点的荧光图像中，坐骨神经在肌肉和爪子的背景下都能清晰可见。尽管背景信号随时间减弱，但坐骨神经仍持续发出明亮的荧光。因此，坐骨神经的信噪比（SBR）逐渐增加，并在 SBR 达到 2.49 时趋于平稳。这些数据表明，MeOTFVP 能够渗透到包括足底区域的神经末梢和肌肉在内的各种组织中，并通过神经元末梢扩散到达 DRG。这一能力证明 MeOTFVP 可有效用于持续的神经成像，突出了其在长期神经学研究中的实用性。
总结
我们合成并表征了一种名为 MeOTFVP 的细胞膜靶向聚集诱导发光团（AIEgen），它具有神经元追踪和成像的特定功能。MeOTFVP 能选择性地追踪从爪子投射的背根神经节（DRG）神经元，注射后能特异性地避开胶质细胞和巨噬细胞。MeOTFVP 成功标记了从爪子到 DRG 的整个坐骨神经通路，注射 MeOTFVP 的小鼠的坐骨神经呈现出强烈的近红外荧光。这项研究结果强调了细胞膜靶向 AIEgens 在神经元追踪和成像方面的潜力，为神经元示踪剂的分子设计提供了一种有前景的策略。
参考文献
Neuronal Tracing and Visualization of Nerve Injury by a Membrane-Anchoring Aggregation-Induced Emission Probe,Rufan Mo,Ying Peng,Zeyang Ding,Huilin Xie, Zijie Qiu, Parvej Alam, Yong Liu, Gang Chen, Jianquan Zhang,* Zheng Zhao,* and Ben Zhong Tang*,ACS Nano 2025, 19, 1070−1079,https://doi.org/10.1021/acsnano.4c12754
