内容提要
本研究开发了含有罗丹明衍生物和肼反应基团的远红色荧光探针1，用于过氧亚硝酸盐的检测和成像。该探针具有细胞渗透性，荧光检测过氧亚硝酸盐的灵敏度和选择性高于其他ROS/RNS，成功用于HeLa和RAW 264.7细胞中外源性和内源性过氧亚硝酸盐的检测。1也可用于检测铜绿假单胞菌（PAO1）感染小鼠骨髓源性中性粒细胞中产生的内源性过氧亚硝酸盐。
探针设计与合成
为了探索其作为ONOO−荧光探针的提议，三步合成罗丹明基肼1。6-氨基-1-四酮首先转化为其N，N-二甲基衍生物2，然后转化为3。在（苯并三唑-1-酰基）六氟磷酸三吡啶二膦（PyBOP）存在下，3与一水合肼缩合，然后以85%的收率生产1。
ONOO−的检测机制
首先探索了使用1跟踪ONOO−缓冲溶液（PBS, 1.0 mM, pH = 7.4）的能力。自由探针1在PBS缓冲液中无色且几乎无荧光，这是由于螺环系统的存在导致两个胺取代芳烃环无法结合。将ONOO−添加到1（10 μM, pH 7.4）的PBS溶液中，结果显示，以600 nm为中心的吸收带呈剂量依赖性，并呈现淡蓝色。这种变化是由螺内酰胺环打开和产生罗丹明样发色团引起的。此外，ONOO−的加入导致荧光带显著、快速和剂量依赖性的发展，其最大值在638 nm处。在638 nm处，ONOO−的添加量为bb0 40 μM时，荧光强度的增加达到一个平台，相当于荧光增强了约80倍。此外，在0 ~ 34 μM范围内，638 nm处的荧光增强与ONOO−浓度呈良好的线性关系。根据3σ/k公式估计，1的检出限为45 nM，表明该探针非常适合高灵敏度的ONOO−检测。1与ONOO−反应形成的混合物的质谱（MS）分析表明，在467.2345 （m/z）处出现了一个新的峰，这与所提出产物的计算值（467.2329 (m/z)）非常匹配。
探针1对ONOO−的选择性
我们测试了1对一组ROS和RNS的响应，以确定其检测ONOO−的选择性。1的荧光增强只能由ONOO−触发，当加入其他ROS/RNS时，其荧光没有明显变化。为了进一步评估1在生化系统中用于ONOO−检测的潜力，研究了pH对1对ONOO−荧光响应的影响。在pH值5 - 11范围内，638 nm处ONOO− 1的荧光开启响应没有显著变化，在生物学相关的pH值6 - 9范围内，对ONOO−的响应是恒定的。
HeLa细胞外源性ONOO−成像
我们下一步研究了使用共聚焦荧光显微镜观察活细胞中ONOO−的潜在用途。我们观察到，1（10 μM）作用30 min后，HeLa细胞显示微弱的荧光。相比之下，1（10 μM）预孵育的细胞在ONOO−generator 3- morpholinosydnon亚胺盐酸盐（SIN-1）处理后呈现出明亮的红色荧光。此外，用ONOO−清除剂ebselen预处理后，红色荧光明显降低。这些观察结果表明，1是一种很有希望检测活细胞中外源性ONOO−的探针。
RAW 264.7细胞内源性ONOO−成像
RAW 264.7巨噬细胞在炎症和免疫过程中产生ROS/ RNS，作为生物测定模型，进一步证明LPS和IFN-γ预处理的效用，在1 （10 μM）孵生30分钟后显示微弱的荧光信号。与之形成鲜明对比的是，LPS和IFN-γ刺激的细胞在1 （10 μM）孵生后显示明亮的红色荧光信号。为了获得进一步的信息，研究人员利用依布selen清除LPS和IFN-γ刺激RAW 264.7细胞产生的ONOO−。正如预期的那样，在受刺激的细胞中看到的明亮的细胞荧光在用ebselen预处理的细胞中严重减弱。1可以在RAW 264.7细胞中成像内源性ONOO−。
内源性ONOO−在pao1感染小鼠骨髓源性中性粒细胞中的成像
我们进一步探讨了1在pa01感染小鼠骨髓源性中性粒细胞（bmdn）中检测ONOO−的适用性。首先，我们研究了1是否可以用于检测ONOO−供体SIN-1处理过的bmdn中产生的ONOO−。结果表明，加入SIN1后，经bmdn预处理的1的荧光强度呈时间依赖性增加，而不加入SIN1时，bmdn的荧光强度没有明显变化。据报道，Nox2在phorbol myristate acetate （PMA）刺激的中性粒细胞样细胞中负责ONOO−的生成因此，我们研究了1是否可以用于检测野生型小鼠（Nox2+/+）或Nox2缺陷小鼠（Nox2−/−）离体感染（即分离的原代中性粒细胞感染病原体如PAO1）提取的bmdn中ONOO−浓度的变化。图中所示的图像显示，在pao1感染的Nox2+/+ bmdn中，1的荧光更强烈。然而，在pa01感染的Nox2−/−bmdn和pa01感染的Nox2+/+ bmdn中，用NOX抑制剂二苯乙酮（DPI）预处理后，1的荧光强度没有明显变化。
共聚焦显微镜也证明了1可以用于监测被gfp标记的PAO1感染的Nox2+/+ bmdn中ONOO−浓度的增加。该方法还显示，gfp标记的PAO1不会在Nox2 - / - bmdn中产生ONOO−。此外，使用肺部感染小鼠模型的实验结果表明，1可以用于检测PAO1感染的Nox2+/+小鼠BAL液中中性粒细胞中ONOO−的增加，并且在PAO1感染的Nox2 - / -小鼠中不会产生ONOO−。上述结果表明，1可能适用于通过特异性检测中性粒细胞体内和体外的ONOO−来监测呼吸道传染病。在哺乳动物系统中，先天免疫细胞（包括中性粒细胞和巨噬细胞）中ONOO−的生成不受控制，可能导致炎症性肠病和神经退行性疾病等疾病因此，使用1进行ONOO−检测可以在这些疾病的诊断中发挥重要作用。
总结
我们开发了一种新的基于罗丹明衍生物的荧光探针，用于检测通过肼基反应起作用的ONOO−。与其他ROS/ RNS相比，该探针对ONOO−具有较高的灵敏度和选择性。1和ONOO−的反应产物具有较长的吸收（600 nm）和发射（638 nm）波段。该探针还用于对小鼠感染模型的HeLa细胞中的外源性ONOO−和RAW 264.7细胞中的内源性ONOO−以及中性粒细胞中的ONOO−进行成像。
参考文献
A Far-Red-Emitting Fluorescence Probe for Sensitive and Selective Detection of Peroxynitrite in Live Cells and Tissues,Di Wu,Jae-Chan Ryu, Youn Wook Chung,Dayoung Lee,Ji-Hwan Ryu*,Joo-Heon Yoon*,and Juyoung Yoon*,Anal. Chem. 2017, 89, 10924-10931,DOI: 10.1021/acs.analchem.7b02707
