内容提要
本研究设计并探索了5种具有荧光报告结构的近红外菁染料Cy71−5，这些染料被不同的硝基芳香族修饰，可能用于快速检测NTR。只有对硝基苯甲酸酯修饰的菁氨酸探针（Cy7-1）可以作为NTR监测和生物成像的快速近红外荧光增强探针。当Cy7-1被NTR催化还原为Cy7-NH2时，电吸基团诱导的电子转移过程被阻断，在检测过程中表现为荧光强度增强。缺氧A549细胞的共聚焦荧光成像证实了Cy7-1在细胞水平上对NTR的检测能力。Cy7-1可以在小鼠缺氧肿瘤模型中检测肿瘤缺氧，显示出快速而显著的近红外荧光特性增强，适合荧光生物成像。
为了优化探针结构，我们选择了不同的连接基团和不同的硝基位置来研究探针的结构-功能关系。固定对硝基苯基和菁基，将连接键从−COO改为O和S，得到的探针Cy7-1、Cy7-2和Cy7-3能够洞察连接键的影响。然后通过固定酯键连接菁部分和芳香族基团，将硝基从对苯基位置引入邻苯和间苯基位置，得到探针Cy7-2和Cy7-3，并探讨芳香硝基位置的影响。由于芳香硝基具有很强的吸电子性，因此有理由认为这些探针的荧光可以被猝灭与NTR反应后，硝基被还原，从而抑制了分子内的电子转移过程，这可能对应于菁氨酸荧光发射的恢复。
Cy7-1−5对硝基还原酶的光学性质
以少量DMSO或乙醇为助溶剂（约1 - 10%），花菁染料可以很容易地溶解在H2O和缓冲溶液中，如磷酸盐或Tris缓冲液。为了避免Cy7-1−5在缓冲体系中聚集，缓冲体系被鉴定为0.05 M Tris， 1.5% DMSO作为共溶剂。在这个缓冲系统中，所有的探针都显示出从可见光到近红外的扩展吸收区域，它们的吸收最大值在764和784 nm之间，这些探针的吸收最大值移动了大约20 nm。在730 nm激发下，除了Cy7-2红移约20 nm外，这些探针显示出相似的近红外发射带。然而，探针的荧光强度不同，对于Tris缓冲液中的Cy7-1−5，测得的绝对量子产率分别为<0.1%,<0.1%,1.1%,<0.1%和0.3%。这些特征表明吸电子基团诱导的电子转移过程抑制了荧光发射。
利用荧光发射光谱研究Cy7-1−5对NTR的响应函数。在NADH存在的情况下，添加0.25 μg mL−1的NTR， Cy7-2−5探针的荧光强度无明显变化，但Cy7-1探针的荧光强度显著增强约110倍。为了确定NTR还原硝基到氨基物质的增强荧光，我们还合成了Cy7-NH2的还原产物，研究其光物理性质。Cy7-NH2的近红外发射波段与Cy7-1相似，但其荧光强度比Cy7-1高2个数量级，在Tris缓冲液中的绝对量子产率为1.8%。
由于Cy7-1已被证明是一种适合用于NTR检测的近红外荧光探针，我们利用荧光发射技术进一步研究了Cy7-1与NTR相互作用的动力学。加入NTR后1 min内荧光发射扫描明显增强，表明对酶的响应速度极快。而且，随着NTR浓度的增加，达到最大荧光强度所需的时间逐渐缩短。增加的酶浓度增强了它的催化能力，加速了含硝基探针还原为荧光胺的速度同样的荧光增强也可以使用EMCCD相机作为检测器进行监测。最大荧光强度随NTR浓度的增加而增加。这种正相关关系表明，光强可以直接反映NTR浓度。
为了进一步研究Cy7-1的反应选择性，研究了各种潜在干扰物质，如盐（K+、Na+、Ca2+）、氨基酸（酪氨酸、甘氨酸、谷氨酸、色氨酸、精氨酸）、葡萄糖、维生素C、活性氧（H2O2、KO2）、溶菌酶和牛血清白蛋白。如图所示，在500 μM NADH存在下，将这些潜在干扰物质加入到Cy7-1 （10 μM）中，没有观察到明显的荧光增强。值得注意的是，当加入0.25 μg mL−1的NTR时，荧光增强与之前一样明显。此外，还研究了氧化还原系统中的一些干扰物质，如电子转运体（细胞色素b5、细胞色素c）和氧化还原酶（亮氨酸脱氢酶、谷胱甘肽还原酶和甲酸脱氢酶）。这些酶和电子转运体对Cy7-1没有反应性，也不会干扰Cy7-1对NTR的荧光响应。因此，Cy7-1对NTR具有较好的选择性。
Cy7-1对缺氧A549细胞硝基还原酶的荧光成像
为了评估Cy7-1在细胞内NTR监测中的适用性，对A549细胞进行了共聚焦荧光显微镜观察，已知A549细胞在缺氧条件下表达NTRA549细胞在常压条件（20% O2）和不同缺氧条件（10%、5%、3%和1% O2）下培养6 h，然后用5 μM Cy7-1处理10 min。常压条件下培养的A549细胞近红外荧光信号非常弱。而A549细胞在低氧浓度下培养时，近红外区荧光信号增加，说明A549细胞在不同氧浓度下可以表达不同的NTR浓度。在不同缺氧条件下培养的细胞中，探针Cy7-1可被表达的NTR催化还原，荧光强度增加。
Cy7-1在缺氧A549荷瘤小鼠模型中硝基还原酶的体内荧光成像
进一步研究了Cy7-1作为动物体内生物成像荧光探针的适用性。将Tris缓冲液中的Cy7-1直接注射到活体小鼠的A549肿瘤中，在730 nm连续激发下，功率密度为1 mW cm−2，通过EMCCD相机在800±12 nm处收集发射光谱。为了动力学观察Cy7-1注入小鼠肿瘤前后荧光强度的变化，在小鼠旁边放置一根装有Cy7-1 (20 μM) Tris缓冲液的试管。在长期跟踪期间，试管中的Cy7-1基本上是不发射的。注射Cy7-1后，肿瘤区域（d = 12 mm）的荧光强度在2 s内明显增强，注射部位的荧光强度在3 min内达到最高，约高出8倍。随着跟踪时间的延长，增强的荧光强度逐渐从注射部位向整个肿瘤区域扩散。如前所述，将Cy7-1探针注入肿瘤后，被肿瘤产生的NTR催化还原为Cy7-NH2，使整个肿瘤荧光持续30 min以上。
本研究设计的5个探针（Cy7-1−5），只有通过酯键连接探针（Cy7-1）修饰的对硝基芳香族探针（Cy7-1）对NTR的响应速度快（<1 min），灵敏度高，选择性好，荧光开启（约110倍）。动力学光学研究和其他实验支持提出的NTR催化还原机制。Cy7-1的硝基被NTR还原生成Cy7-NH2，抑制了电吸基团诱导的电子转移过程，导致荧光增强。过表达NTR的缺氧A549细胞的共聚焦荧光成像显示Cy7-1在细胞水平上检测NTR的能力。更重要的是，注射Cy7-1后缺氧的A549肿瘤在2 s内发出荧光，且效果持续时间长（至少30 min）。Cy7-1不仅可以用于区分不同大小肿瘤的缺氧程度，还可以在体内区分缺氧肿瘤和炎症组织，进一步突出了Cy71的潜在诊断应用。这种低氧肿瘤光学成像方法方便、操作简单、价格低廉。我们成功的近红外荧光开启系统为进一步的高灵敏度体内硝基还原酶成像研究提供了新的设计策略。
参考文献
Ultrasensitive Near-Infrared Fluorescence-Enhanced Probe for in Vivo Nitroreductase Imaging,Yuhao Li, Yun Sun, Jiachang Li, Qianqian Su, Wei Yuan, Yu Dai, Chunmiao Han, Qiuhong Wang, Wei Feng,* and Fuyou Li*,J. Am. Chem. Soc. 2015, 137, 6407−6416,DOI: 10.1021/jacs.5b04097
