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内容提要

    本文报道了首例能够监测铁自氧化过程中痕量・OH 生成的灵敏荧光・OH 探针（1）。探针1的设计利用了・OH 独特的芳香羟基化反应和亲电特性，通过在花菁荧光染料中引入强给电子的甲氧基来增强对・OH 的捕获能力从而制备得到。探针1与・OH 反应会形成更大的 p - 共轭体系，并产生近红外荧光从关闭到开启的响应。通过对铁自氧化及各种刺激条件下活细胞中产生的・OH 进行成像，证明了探针1的性能，结果显示 RAW 264.7 细胞中・OH 的基础水平低于HeLa细胞。

结果与讨论

    首先，・OH 的羟基化反应为实现高选择性提供了基础。其次，Shabat 等人开发了一种方法，基于具有供体 - 双受体特征的花菁分子的 p 电子系统发生显著变化，在这类花菁分子中引入荧光开关机制（例如 QCy7）；此外，・OH 对芳香化合物的进攻具有亲电性。因此，我们设想可以利用这些发现和特性，通过在花菁荧光团的中间苯环上引入强给电子的甲氧基，设计一种新型的荧光开关探针1，从而显著提高对・OH 的捕获能力。同时，还制备了用氢和吸电子卤素取代的对照探针2 - 5。探针1具有对称结构，带有两个正电荷和两个小的 π 共轭体系，这导致其吸收和发射波长较短。然而，中间苯环 4 位的羟基化以及随后生成的酚的去质子化，会通过电子重排产生更大的聚甲炔 p 共轭体系（产物 1）。从探针1到产物1的 π 共轭扩展变化，导致发射光发生大幅红移，近红外（NIR）荧光信号产生极大的反差，使探针1能够在・OH 检测中实现高灵敏度。

    在 pH 7.4 的磷酸盐缓冲溶液中对它们的光谱性质进行了检测。这五种探针在 300nm 激发时，均在约 300 - 377nm 处显示出相似的吸收峰，在 500 - 115nm 左右出现荧光峰。然而，当用其产物的较长激发波长 570nm 激发时，这些探针几乎不显示荧光。

    随后，在 pH 7.4 的磷酸盐缓冲溶液中，利用芬顿反应体系研究了这些探针对・OH 的荧光响应。在该体系中，Fe²⁺与 H₂O₂ 反应生成・OH，并且使用 Fe²⁺ -EDTA 螯合物来避免 Fe²⁺ 在 pH 7.4 的介质中可能发生的沉淀。采用电子顺磁共振（ESR）光谱分析来确认芬顿试剂（等摩尔的 Fe²⁺ -EDTA 和 H₂O₂ ）是否产生了・OH，5,5 - 二甲基 -1- 吡咯啉 - N - 氧化物（DMPO）被用作・OH 的特异性自旋捕获剂。在各种对照组中，包括两个重要的含铁体系（DMPO + Fe²⁺ -EDTA 或 DMPO + Fe²⁺ ），均未观察到明显的 ESR 信号；然而，只有在同时存在 Fe²⁺ -EDTA 和 H₂O₂ 时，才能检测到 DMPO/・OH 加合物的显著 ESR 信号，这表明芬顿试剂能有效地产生・OH。当使用这些探针检测・OH 时，甲氧基取代的探针1对・OH 表现出最高的灵敏度，在 653nm 处荧光增强约 122 倍，并且发射光发生了较大的红移（138nm）；而氢取代和卤素取代的探针 2 - 5 的荧光增强倍数分别仅约为 35 倍、14 倍、13 倍和 19 倍。因此，由于探针1具有更好的性能，后续研究采用了探针 1。

    为了探究探针1与・OH 的反应机理，我们制备了两种可能的产物1和 2：产物 1（甲氧基间位取代产物）可通过・OH 对探针1的羟基化反应直接得到。通过多种光谱分析方法对产物1和 2 的结构进行了表征。理论上，探针1与・OH 反应时，产物 2 应是主要产物，产物1可能是次要产物。然而，在本研究的特殊情况下，HPLC 分析表明产物1的产率（峰面积 4.7%）甚至高于产物2（峰面积 3.6%），这显然是因为产物1能够形成稳定且更大的 p - 共轭结构。因此，探针1的羟基化反应倾向于生成产物1作为主要产物。对具有供体 - 双受体特征的2,6 - 二氟苯甲醚模型化合物的研究进一步支持了我们探针与・OH 的设计策略和反应机理。对反应时间和 pH 影响的研究表明，在生理 pH 值 7.4 的条件下，反应 30 分钟适合使用探针1检测・OH。在优化条件下，研究了探针1对不同浓度芬顿试剂的荧光响应。在 0 - 60 μM 的浓度范围内，检测到显著的荧光增强，且呈良好的线性关系，其线性方程为F=6.42×[芬顿试剂]（μM） + 5.091（R² =0.986），其中 F 为荧光强度。该方法的检测限（3s/k）低至 38 nM 芬顿试剂。

    基于探针1的高选择性和超高灵敏度，研究人员用其检测铁自氧化过程中产生的痕量・OH。在该实验中，对用于电子自旋共振（ESR）分析的完全相同的反应体系，用探针1进行荧光检测。正常芬顿反应产生的・OH，ESR 和探针1都能轻松检测到。令人惊讶的是，在 ESR 检测不到・OH 的Fe²⁺-EDTA 和Fe²⁺体系中，探针1却检测到了强荧光，且Fe²⁺-EDTA 体系产生的荧光信号更强，这是因为 EDTA 的存在能更有效地生成・OH 这清楚地表明，探针1能够检测到铁自氧化过程中产生的痕量・OH。对反应时间和 pH 值影响探针1检测铁自氧化过程中・OH 的研究表明，荧光响应在 10 分钟时达到最大值，最适 pH 范围为 7.2 - 8，这与芬顿反应体系中的情况几乎一致。在不同浓度Fe²⁺条件下，铁自氧化产生的・OH 与荧光强度之间的关系。在常氧条件下，较低Fe²⁺浓度（不超过 40μM）范围内，二者呈良好的线性关系；较高浓度的Fe²⁺会导致非线性关系，甚至荧光强度略有下降，这可能是由于Fe²⁺对・OH 的清除作用。此外，在缺氧条件下，Fe²⁺存在时产生的荧光要弱得多，这表明溶解氧是铁自氧化不可或缺的条件。另一方面，在相同条件下，对比探针1和广泛使用的商业探针香豆素 - 3 - 羧酸（3 - CCA）对铁自氧化产生的・OH 的荧光响应，结果显示探针1的灵敏度至少是 3 - CCA 的 4 倍。这表明探针1非常适合检测痕量・OH。

    我们利用探针 1，通过共聚焦荧光显微镜探究其监测活细胞内・OH 水平的性能。在本实验中，选择 HeLa 细胞作为模型，外源・OH 由芬顿试剂（H₂O₂+Fe²⁺- EDTA\)）产生。未处理细胞的图像中没有明显荧光，而用探针孵育的细胞则观察到显著荧光，这表明探针1足够灵敏，能够检测到・OH 的基础水平。添加NaOCl、SIN - 1（ONOO-供体）或H₂O₂不会引起显著的荧光变化，这也证明了该探针在活细胞中检测・OH 具有高选择性。此外，用仅含Fe²⁺- EDTA\)或芬顿试剂孵育负载探针的HeLa细胞，会使荧光信号增强（分别增强 2 倍或 4.5 倍）。为证实荧光增强是探针响应生成的・OH 所致，在添加芬顿试剂前，用 tempol（・OH 清除剂）预处理另一组负载探针的细胞 30 分钟。结果显示，这种处理显著抑制了荧光。此外，已证实 tempol 本身几乎不影响探针1与・OH 反应产物的荧光。对 RAW 264.7 细胞进行相同实验，也获得了几乎相似的结果。最有趣的是，我们发现 RAW 264.7 细胞本身与负载探针的细胞之间的荧光差异不显著，这与 HeLa 细胞的情况大不相同。这表明，假设探针在两种细胞系中的反应特性相同，RAW 264.7 细胞中・OH 的基础水平可能低于 HeLa 细胞。此外，由于探针1带正电荷的特性，它显示出良好的线粒体靶向能力，但不具备溶酶体靶向能力。探针1的这一特性有助于检测线粒体中的・OH，而线粒体是细胞内活性氧的主要来源。上述所有结果表明，探针1适合检测细胞内的・OH。研究人员使用探针1监测未添加H₂O₂的铁过载 HeLa 细胞在铁自氧化过程中产生的・OH。当细胞分别用 100μM 或 500μM 的Fe²⁺处理时，可观察到荧光分别增强 1.7 倍或 2.9 倍，并且・OH 清除剂 tempol 能有效消除Fe²⁺诱导的荧光信号，这表明细胞内的铁自氧化能够产生・OH。此外，研究人员分别通过标准 MTT 检测和硫代巴比妥酸（TBA）反应测定了铁自氧化引起的细胞毒性和脂质过氧化水平，结果显示铁自氧化会产生明显的细胞毒性和脂质过氧化。这意味着铁自氧化对活细胞有害。

    此外，已知 RAW 264.7 细胞在脂多糖（LPS）和重组干扰素 -γ（IFN-γ）处理下会产生活性氧（ROS），其中包括・OH。因此，使用探针1来检测 LPS/IFN-γ 刺激下・OH 的生成情况。经刺激的 RAW 264.7 细胞荧光增强约 2.4 倍，且增强的荧光也能被 tempol 有效抑制，这表明探针1也可用于监测 LPS/IFN-γ 刺激下・OH 的生成。在缺氧条件下，细胞内诸如Fe²⁺和 NADH 等各种还原性物质会积累，这些物质能将剩余的氧气O₂还原为超氧阴离子O₂^-- ，进而导致包括・OH 在内的活性氧（ROS）过量产生。因此，我们尝试用探针1监测缺氧条件下 HeLa 细胞和 RAW 264.7 细胞等活细胞内・OH 水平的变化。HeLa 细胞在含 5% 和 1% 氧气的环境中缺氧孵育 24 小时后，荧光分别增强 5.0 倍和 13.3 倍，并且增强的荧光可被 tempol 抑制，这意味着缺氧可能会导致细胞内・OH 增多。在 RAW 264.7 细胞中也观察到类似但水平较低的・OH 变化情况，这与上述发现一致。

总结

    基于・OH 独特的芳香羟基化反应和亲电特性，我们开发了一种灵敏的荧光・OH 探针。该探针发生选择性羟基化反应以及随后的去质子化过程，会形成更大的p -共轭体系，产生近红外荧光开关响应。探针1具有良好的生物相容性，可用于对不同条件下活细胞中产生的・OH 进行成像。值得注意的是，探针1极高的灵敏度使其能够检测到铁自氧化过程中产生的痕量・OH，而这些痕量・OH 通常无法用电子自旋共振（ESR）等其他方法检测到。

参考文献

Rationally Designed Fluorescence COH Probe with High Sensitivity and Selectivity for Monitoring the Generation of COH in Iron Autoxidation without Addition of H₂O₂,Hongyu Li, Xiaohua Li,* Wen Shi,* Yanhui Xu, and Huimin Ma*,Angew. Chem. Int. Ed. 2018, 57, 12830 –12834,DOI: 10.1002/anie.201808400