内容提要
本文报告了一组具有双噻吩取代苯并双噻二唑结构的小分子，这些小分子通过自堆叠而非外部基底来增强拉曼信号。堆叠诱导电荷转移增强拉曼散射（SICTERS）的技术中，自堆叠的小分子形成有序的空间排列，使得相邻分子之间能够进行三维电荷转移。SICTERS 纳米探针的拉曼散射截面比类似粒径的传统 SERS 金纳米探针高 1350 倍。在体内成像的灵敏度、分辨率和成像深度方面，SICTERS 优于 SERS。SICTERS 能够对血液和淋巴管系统进行无创拉曼成像。
自堆叠小分子的拉曼增强
以一类具有双噻吩基取代苯并双噻二唑结构的 π 共轭分子为代表，比如 4,7 - 二（噻吩 - 2 - 基）苯并 [c][1,2,5] 噻二唑（DTBT；4 号化合物），以及它带有两条烷基链的衍生物 4,7 - 双（4-（2 - 乙基己基）噻吩 - 2 - 基）苯并 [c][1,2,5] 噻二唑（BBT；19 号化合物）。用 785nm 或 830nm 的近红外（NIR）激光照射固态的 BBT，会产生共振拉曼散射，在894和1264cm-1处出现特征且强烈的拉曼光谱特征，但用 532nm 激光照射则不会。通过将 BBT 或 DTBT 与其结构单元进行对比，研究了这两个特征峰的归属。去掉 DTBT 的两个噻吩后（7号化合物），这两个光谱特征就消失了。单独的噻吩或者苯基噻吩（11 号和 12 号化合物）也没有显示出这些特征拉曼峰。在 DTBT 的结构中，把中心的苯并双噻二唑换成二硝基取代的苯并噻二唑（14 号化合物），或者把两个噻吩单元换成苯基（5号化合物），这两个光谱特征也会消失。不过，在噻吩部分的 α 位连接溴或苯基的 BBT（20 号和 21 号化合物）却拥有这两个特征峰。这些数据表明，894 和(1264cm-1)处的峰源自整个主链（也就是 DTBT）的振动模式。亲脂性的 BBT 通过自堆叠，在水中展现出增强的拉曼散射。在水和四氢呋喃（THF）的混合液（50%:50%）中，BBT 能溶解，但不会出现拉曼特征峰。当水的比例增加到 60% 时，BBT 开始聚集，在 894(cm-1)处出现拉曼峰。随着水比例进一步增加，BBT 的拉曼信噪比（S/N）持续上升，这和分子聚集程度增加有关。
晶体在面内方向形成主链 - 主链排列，一个 DTBT 分子中噻吩的碳原子与相邻 DTBT 分子中苯并双噻二唑的硫原子之间的间隙为(3.552 Å)。同时，分子在面外方向堆积，构成连续的 T - T 堆叠，上层分子平面中噻吩的硫原子与下层平面中苯并双噻二唑的氮原子之间的距离为(3.582 Å)。根据电磁理论，拉曼散射强度与电偶极矩（p）的平方成正比，其中p等于分子极化率与电场强度的乘积。由供电子和吸电子基团共轭形成的具有供体 - 受体 - 供体（D - A - D）结构的小分子，具备良好的分子内电荷转移特性，有助于提升分子极化率。静电势（ESP）图结果显示，由于形成了强 D - A - D 系统，DTBT 或 BBT 的分子内电荷转移特征和极化率相较于苯并双噻二唑显著增强。这四种分子的最高占据分子轨道和最低未占据分子轨道也表明，共轭 D - A - D 系统增加了电子离域程度，降低了能隙（(E_g)），有利于电荷转移激发。更重要的是，ESP 图描绘出一个 DTBT 分子的噻吩单元与面内方向堆叠的相邻分子的苯并双噻二唑单元之间存在强分子间电荷转移相互作用。在面外方向，上层分子平面中的噻吩单元堆叠在下层平面中苯并双噻二唑单元的顶部，同样促进了分子间电荷转移相互作用（图 3e 右，框选区域）。因此，无论是面内还是面外方向堆叠的两个 DTBT 分子，其分子极化率都提高了一倍。增强的分子间电荷转移相互作用源于 DTBT 晶体中面内(3.552 Å)和面外(3.582 Å)的分子间间隙。如此近距离的分子间 D - A 距离促进了较强的分子间电荷转移相互作用。此外，DFT 计算表明，在任一方向堆叠的两个 DTBT 分子中原子的振动幅度和方向是同步的，这使得(894 cm-1)处的拉曼强度增强了约 20 倍。此外，我们制备了 BBT 的单晶，并通过单晶 XRD 实验对其分子堆积进行了表征。晶体结构清晰地显示，通过沿 c 轴的主链 - 主链堆叠，一个 BBT 分子中噻吩的硫原子与相邻 BBT 分子中苯并双噻二唑的氮原子之间的分子间距离为(3.427 )。BBT 分子在面外方向堆积，形成连续的 π - π 堆叠，一个分子平面中噻吩的硫原子与另一个分子平面中苯并双噻二唑的氮原子之间的距离为(3.618 Å)。我们进一步分析了 BBT 在不同水比例的 THF 溶液中的吸收光谱。当 THF 与水的混合溶液中水的比例增加到 60% 或 95%（聚集态）时，BBT 的吸收光谱出现红移且变宽的峰，这表明存在激子耦合，进一步证实了分子间电荷转移相互作用。此外，BBT 聚集程度的增加导致其荧光寿命缩短，这也表明存在分子间电荷转移。综上所述，SICTERS 效应要求小分子（如 DTBT 或 BBT）具有基于 D - A - D 的平面构象和面内多环振动模式。DTBT 或 BBT 的分子堆叠促进了面内或 c 轴方向以及面外方向的分子间电荷转移。结果，一个受体可以从六个供体（(D_2-A cdots D_4)）接收电子，包括两个分子内供体和四个分子间供体。同时，一个供体可以向三个受体（(A - D cdots A_2)）提供电子，包括一个分子内受体和两个分子间受体。这些空间排列重新调整了电荷分布，形成三维电荷转移，大幅提高了极化率和共振拉曼散射。
SICTERS 纳米探针的制备
我们利用两亲性的 1,2 - 二硬脂酰 - sn - 甘油 - 3 - 磷酸乙醇胺 - N-[甲氧基 -(聚乙二醇)-2000]（DSPE-PEG）包裹 BBT，制备了 SICTERS 纳米探针，从而形成核壳结构的 BBT 纳米颗粒（NPs）。BBT 纳米颗粒中每个 BBT 分子的拉曼散射截面，与水THF（95:5，体积比）混合物中 BBT 聚集体的拉曼散射截面相近。不同直径（约 42nm 与约 70nm）的 BBT 纳米颗粒，其每个分子的拉曼散射截面大致相等。这些结果表明，DSPE-PEG 的纳米组装方式以及颗粒尺寸，并未改变 BBT 堆叠时的分子间距。
微小肿瘤的术中实时成像
利用我们之前报道的术中共聚焦拉曼成像平台，我们对基于 SICTERS 的纳米探针和具有 SERS 活性的纳米探针在携带原位 CT26-Luc 结肠肿瘤的小鼠中进行了对比研究。在模拟手术场景中，基于 BBT 纳米颗粒的术中 SICTERS 成像在静脉注射后 15 分钟或 4 小时，可在血管中产生强烈的拉曼信号，而在 24 小时时可获得清晰的肿瘤图像。这很可能是因为注射后 24 小时 BBT 的血浆浓度降至 15 分钟时的 15.6%，且 BBT 纳米颗粒在肿瘤中的积累足够。该成像技术能够实时区分原发性肿瘤（5.8 毫米 ×6.3 毫米，蓝色箭头）和卫星转移性病灶（0.49 毫米 ×0.54 毫米，绿色箭头）与正常组织，在 894(cm-1)处具有很强的特征信号强度。苏木精和伊红（H&E）染色证实这些拉曼信号阳性区域为肿瘤病灶。SICTERS 成像检测到的转移性微小肿瘤的最小尺寸小至约 0.25 毫米 ×0.35 毫米，这一尺寸与之前报道的通过 SERS 检测到的腹部肿瘤转移灶的尺寸相当。相比之下，注射磷酸盐缓冲盐水（PBS）的对照组没有产生任何特征拉曼峰。为了研究 BBT 纳米颗粒对肿瘤组织的穿透能力，我们在注射 BBT 纳米颗粒 24 小时后，从小鼠体内分离出长度约 2.5 毫米的微小肿瘤，并通过在不同肿瘤深度进行冷冻切片检查。BBT 纳米颗粒可以穿透到微小肿瘤的核心，并在 1258μm 的穿透深度处分布于整个肿瘤横截面。在原位 CT26 结肠癌小鼠模型中，BBT 纳米颗粒的这种肿瘤组织穿透深度足以用于术中检测微小肿瘤。对于 SICTERS 成像，肿瘤中 BBT 的拉曼信号强度呈剂量依赖性，通过六次重复实验验证，最低注射剂量低至 1mg/kg BBT。
淋巴管引流和血管的无创成像
SERS 仅能在手术中切开皮肤暴露淋巴结时对其进行成像。与先前的报道一致，在小鼠前爪皮内注射 NBT@Au GERTs（含 80μg 金）无法实现对腋窝淋巴结（ALNs）的透皮拉曼成像。直到去除皮肤暴露淋巴结后，才完成其特征性拉曼成像。同样，基于 SERS 的 BBT@Au NPs（含 80μg 金）除非去除皮肤，否则不会产生任何拉曼信号。相比之下，注射最低剂量为 20μg BBT 的 BBT NPs 即可实现对腋窝淋巴结的无创透皮成像值得注意的是，基于 SICTERS 的拉曼成像能够无创地描绘 BBT NPs 从注射部位到淋巴结间集合淋巴管和腋窝淋巴结的引流过程。BBT NPs 的高信噪比使其能够高分辨率地区分腋窝淋巴结（部位 6）或淋巴管（部位 5）与周围组织（部位 4）。所选淋巴管的横截面强度分布显示，SICTERS 测得的半高宽（FWHM）约为 246μm。拉曼成像中的阳性信号区域与切除的腋窝淋巴结的 H&E 染色结果相关性良好。通过用不同厚度的猪皮切片覆盖腋窝淋巴结，发现 SICTERS 的最大成像深度为 1.2mm。通过识别皮下血管和结构特征进行的光学微血管造影，为诊断和监测皮肤疾病（如牛皮癣、血管瘤或皮肤癌）的治疗反应提供了关键信息。雄性 BALB/c 小鼠的皮肤厚度为(750 pm 30 mu m)。静脉注射 BBT NPs（40mg/kg BBT）成功勾勒出了该深度的微血管。皮下微血管的拉曼成像与照片匹配良好（图 6h、i，黄色箭头）。横截面强度分布显示，蓝色虚线穿过的微血管半高宽为 177μm。相比之下，使用 NBT@Au GERTs（40mg/kg 金）的 SERS 对血管的成像较为模糊，半高宽为 601μm，无法检测到较小的血管。此外，静脉注射 BBT NPs 后，小鼠后肢中半高宽小至 106μm 的血管清晰可见。相比之下，NBT@Au GERTs 对大微血管的拉曼成像半高宽为 286μm，无法描绘腿部较小的血管。这些结果表明，BBT NPs 的 SICTERS 效应通过无创拉曼成像清晰地显示了小鼠的皮下和后肢微血管，提供了比使用 NBT@Au GERTs 的 SERS 更好的微血管造影效果。使用 ×50 物镜时，BBT NPs 使小鼠耳朵中的微血管网络突出显示，半高宽小至 11.5μm（图 6o、p）。组织学分析表明，基于 SICTERS 的 BBT NPs 拉曼成像后，小鼠耳朵、腹部或腿部皮肤均未显示出任何损伤。SICTERS 实现了对小鼠皮下微血管的无创高分辨率拉曼成像。
总结
与目前用于拉曼成像体内应用的 SERS 相比，SICTERS 具有两个优势。第一，SICTERS 无需基底增强，从而避免了 SERS 中使用的无机基底带来的生物安全性问题。我们的对比研究表明，具有 SICTERS 活性的小分子可被代谢，而基于 SERS 的金基底则不可代谢，这与之前认为金不可生物降解的报道一致。第二，SICTERS 在体内成像灵敏度、空间分辨率和成像深度方面优于 SERS。SICTERS 的这一优势使其能够对淋巴管引流和半高宽为 11.5μm 的微血管进行高分辨率的无创透皮成像。
参考文献
Self-stacked small molecules for ultrasensitive, substrate-free Raman imaging in vivo，Shuai Gao, Yongming Zhang, Kai Cui, Sihang Zhang, Yuanyuan Qiu, Yunhui Liao, Haoze Wang, Sheng Yu1, Liyang Ma , Hongzhuan Chen , Minbiao Ji , Xiaohong Fang , Wei Lu & Zeyu Xiao ，Nat. Biotech，https://doi.org/10.1038/s41587-024-02342-9
