内容摘要
我们制备了一系列氰基取代的CHC衍生物，发现在香豆素部分的C-4位取代可以有效地扩展吸收波长。这些4CN-CHC衍生物的近红外（NIR）发射显示出很高的组织穿透性，4CN-CHC的双色成像能够比率监测溶酶体pH值的变化。通过调节开/闭平衡可以调节4CNCHC衍生物的相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）信号，并且不同的CARS光谱模式使我们能够进行多组分成像。
氰基取代的CHC衍生物的设计、合成和评价
在CHC支架上安装腈基，以开发具有分子内环化行为的红移CHC衍生物。为了研究腈基的最佳取代位置，我们重点研究了CHC-1的香豆素4位（4CN-）和吲哚5位（5′CN-）。作为合适的分子内亲核试剂，我们选择羟乙基（XH = OH），首先制备了单氰基或二氰基取代的CHC-1衍生物（4CN-CHC-1：R1 = CN，R2 = H; 5′CN-CHC-1：R1 = H，R2 = CN; 4，5 ′diCN-CHC-1：R1 = CN，R2 = CN）。与CHC-1相比，氰基取代的CHC衍生物的吸收光谱和荧光光谱均发生了红移。特别是，4CN-CHC-1和5′CN-CHC-1的吸收/发射波长相对于CHC-1的吸收/发射波长的红移分别为66/33 nm和29/20 nm。4CN-CHC-1显示出比5′CN-CHC-1更长的波长吸收/发射性质和更高的荧光量子产率（4CN-CHC-1：0.052，5′ CH-CHC 1：0.014），表明对于NIR荧光成像，在4位取代似乎优于5′-取代。二取代的4，5 ′diCN-CHC-1在CHC-1衍生物中表现出最长的波长，我们接下来通过用久洛尼定基结构取代N，N-二乙基部分来制备4CNJCHC-1、5′CN-JCHC-1和4，5 ′diCN-JCHC-1，以诱导大的红移。JCHC-1衍生物的红移值比CHC-1衍生物的红移值大，4位取代基的荧光量子产率上级优于5位取代基，双取代基的4，5′diCN-JCHC-1的荧光量子产率小于4，5′diCN-CHC-1。
pKcycl值的多样化
我们评估了开发的CHC衍生物的分子内环化行为。为此，我们确定了分子内环化的平衡常数pKcycl，其定义为化合物的吸光度降低到分子内环化的结果的最大吸光度的一半时的pH。首先，我们测量了CHC衍生物在具有不同pH值的水性介质中的吸收和荧光光谱，并绘制了相应吸收最大值处的归一化吸光度相对于pH的曲线图。结果表明，吸电子腈基增强了CHC支架的亲电性;因此，与母体CHC-1的pKcycl值（pKcycl = 7.6）相比，4CN-CHC-1（pKcycl = 6.3）和5′CN-CHC-1（pKcycl = 6.2）的pKcycl值向酸性侧移动。二取代的4，5′-diCN-CHC-1显示出最低值（pKcycl = 2.9）。与CHC-1衍生物相比，具有久洛尼定基结构的JCHC-1衍生物显示出略微增加的pKcycl值，尽管氰基取代的效果与CHC-1衍生物中的效果大致一致。接下来，我们尝试使氰基取代的CHC衍生物的pKcycl值多样化，因为具有酸性pKcycl值的衍生物优选用于超分辨率成像，而具有碱性pKcycl值的衍生物优选作为用于检测酶活性的支架染料。由于合成的4CN-CHC衍生物显示酸性pKcycl值，我们尝试将4CN-CHC-1和4CN-JCHC-1的pKcycl值向碱性侧移动。
据报道，形成六元环的螺环罗丹明衍生物比形成五元环的螺环罗丹明衍生物具有更高的pKcycl值，并且pKcycl值可以根据分子内亲核试剂的亲核性而变化，所以我们用具有额外亚甲基单元的羟丙基（HP）取代羟乙基（HE）（XH = CH 2 OH; 4CN-CHC-2和4CN-JCHC-2）或具有羧酸酯作为较低亲核亲核试剂的羧乙基（CE）（XH = COOH; 4CN-CHC-3和4CN-JCHC-3）。我们发现，与带有HE基团的衍生物相比，具有HP基团的4CNCHC-2和4CN-JCHC-2仅显示pKcycl值略微增加，表明与螺环罗丹明衍生物的情况相反，从五元环形成到六元环形成的转换对CHC衍生物的pKcycl值几乎没有影响。另一方面，具有CE基团的4CN-CHC-3和4CN-JCHC-3显示pKcycl值显著增加，表明亲核试剂的亲核性在这种情况下可以影响平衡。
作为比率荧光探针进行评价
我们用4CNCHC衍生物对活细胞进行了比率成像。为了研究比率特征，我们测量了4CN-JCHC-1在不同pH值下在488 nm（封闭形式）和633 nm（开放形式）激发的荧光光谱。基于710和646 nm发射的比率（FL 710/FL 646），pKa值计算为5. 5XN-JCHC-1的荧光发射相对较弱，但开放形式和封闭形式的量子产率在有机溶剂中比在水溶液中高得多，表明4CN-JCHC-1将为细胞内成像提供足够的亮度。当我们将4CN-JCHC-1应用于活的HeLa细胞时，我们发现开放形式倾向于主要定位于溶酶体，而封闭形式存在于内膜中。众所周知，罗丹明衍生物倾向于定位在线粒体中，但具有相似化学结构的一些衍生物由于其正电荷而倾向于定位在溶酶体中。因此，我们推测4CN-JCHC-1的开放形式由于其正电荷而定位在溶酶体中。至于细胞内摄取，4CN-JCHC-1可以渗透穿过细胞膜，而不管细胞外pH如何。然而，细胞摄取在低温下减少，表明可能涉及能量依赖性机制，至少部分涉及。此外，为了检查4CN-JCHC-1是否可以监测溶酶体pH变化，加入NH4Cl水溶液以诱导溶酶体pH的中和。加入NH4Cl水溶液后，4CN-JCHC-1的NIR发射减少，表明4CN-JCHC-1适用于监测溶酶体pH变化。为了证实4CN-JCHC-1 pH示踪的广泛适用性，我们还将其应用于两种不同的肺癌细胞系A549和H226。不同细胞系中4CN-JCHC-1的封闭形式的细胞内定位略有不同，例如，在A549细胞中，4CN-JCHC-1的封闭形式倾向于更显著地定位于细胞内的点状物，例如脂滴。然而，在HeLa 细胞中加入NH4Cl溶液后，溶酶体中的荧光信号下降。这些结果表明，在所有三种细胞系中，溶酶体pH值的变化都可以用比率法追踪。然而，对于定量pH测量，细胞内校准将是必要的，因为4CN-JCHC-1的开放和封闭形式的荧光量子产率对环境敏感。我们还证实了我们的探针对生物干扰物质（如活性氧/氮/硫物质和阳离子）具有足够的稳定性。此外，可见光照射几乎不产生单线态氧，并且在用于细胞成像的浓度范围和时间段内没有观察到细胞死亡，表明我们的探针不引起光毒性或细胞毒性。
作为多色可激活拉曼探针的评价
我们采用了宽带相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）显微镜，其具有以1064 nm的NIR激发波长操作的定制仪器。我们首先测量了CHC-1、4CN-CHC-1和4CN-JCHC-1在含有1%（v/v）三氟乙酸（TFA）（酸性条件）或三乙胺（TEA）（碱性条件）的DMSO溶液中的汽车光谱，使平衡分别向开放式和封闭式移动。在4CN-CHC-1和4CN-JCHC-1的情况下，在开放和闭合形式之间的汽车光谱的显著变化被观察到，而在CHC-1的情况下，观察到两种形式之间的差异很小。4CN-CHC-1和4CN-JCHC-1的共轭C-C双键（1200 - 1700 cm-1）和C-N三键（约2200 cm-1）的峰在开放形式下增强，这是由于伴随分子内环化的吸收变化的预共振拉曼效应的结果。在我们的装置中，我们估计在预共振条件下信号增强达到约20 - 30倍，这是在非共振条件下从DMSO（约14 M）的溶剂信号计算的。尽管1064 nm的激发波长似乎与4CN-CHC衍生物的电子预共振吸收波长（约700 nm）相当远，但当CARS信号的波长与电子跃迁一致时发生的CARS过程中的共振仍然可以发生。因此，很可能在汽车中比在受激拉曼散射（SRS）中更容易实现电子预共振增强，即使具有较短的吸收波长。通过比较CHC-1（λabs，open = 576 nm）、4CN-CHC-1（λ abs，open = 642 nm）和4CN-JCHC-1（λabs，open = 675 nm）的振幅，也证实了预共振增强;具体而言，振幅随着吸收波长的红移而增加。
我们评估了4CNCHC衍生物的多重能力，由于4CN-CHC-1和4CN-JCHC-1在指纹区域显示出不同的光谱轮廓，我们期望这两种染料可以用作可区分的拉曼标记物。为了证明这一点，我们将两种染料以各种比例混合并测量CARS光谱。对于该测量，为了简单起见，我们制备了不具有环化能力的“常开”染料（4CN-CHC-0、4CN-JCHC-0）。通过拟合分析发现，从CARS谱中可以很好地估计混合比。这一结果表明，4CN-CHC和4CN-JCHC支架可以通过CARS测量检测并很好地分辨。此外，我们进行了同位素编辑以进一步进行多重检测。我们专注于细胞沉默区的腈峰，合成了另外三种同位素编辑的4CN-CHC-1这些同位素编辑的4CN-CHC-1衍生物显示出几乎相同的物理化学性质（λabs、λem和pKcycl），但腈键的振动峰是可区分的。在矿物油中形成含有染料的水滴，将它们混合，制备含有不同成分的水滴：4CNCHC-1（含TFA的开放型）、413 C15 N-CHC-1（含TFA的开放型）、4CN-JCHC-1（含TFA的开放型）和4CNJCHC-1（含TEA的封闭型）。通过CARS显微镜观察制备的水滴，并且我们通过光谱解混成功地可视化了5种组分（四种液滴和矿物油）这些结果证明了4CN-CHC支架通过指纹区和细胞沉默区中的组合检测用于多重和功能性振动成像的潜在效用。
结论
本研究合成了具有近红外光谱特性的CHC衍生物，它们可以作为可激活荧光探针和可激活拉曼探针的骨架材料，其中香豆素的C4取代可以有效地延长吸收波长。4CN-CHC衍生物显示出分子内环化行为，可以通过引入额外的腈基或替换分子内亲核试剂在宽范围内进行调节。由于其近红外发射范围，4CN-CHC衍生物显示出高的组织渗透性，并且可用于溶酶体pH变化的双色比率监测。此外，它们的CARS信号受开/闭平衡的调节，不同的CARS（Im[χ（3）]）谱型使我们能够进行多组分（Raman）成像。
参考文献
Near-Infrared Coumarin-Hemicyanine Hybrid Dyes Bearing an Intramolecular Nucleophile for Activatable Fluorescence and Raman Imaging,Hiroyoshi Fujioka, Ryo Sakamoto, Kotaro Hiramatsu, Yusuke Murakami, Minori Masaki, Minoru Kawatani, Satoshi Matsumoto, Ryosuke Kojima, Yasuteru Urano, Hideaki Kano, and Mako Kamiya,Anal.Chem.2025,97,17589−17597,https://doi.org/10.1021/acs.analchem.5c02714
