内容提要
本文首次报道aza-BODIPY染料独特且高效的拉曼活性特征。这些独特属性可在分子水平上拓展，当吸附到纳米粗糙金表面时，能够通过 SERS 实现检测。在这些新发现的拉曼报告分子中，氨基取代的衍生物 4 在极低浓度下（对于 4-Au 而言，约为 0.4 mM）仍表现出高信号强度。我们以金纳米颗粒作为 SERS 基底、以 4 作为拉曼报告分子，构建了一种高效的纳米探针（4-Au@PEG），该探针无需任何特异性表面标志物，就能意外地有效识别三种人类癌细胞（肺癌细胞 A549、宫颈癌细胞 HeLa、纤维肉瘤细胞 HT-1080）。我们观察到清晰可辨的拉曼成像图和特征性特征峰，而在正常成纤维细胞（3T3L1）中未观察到此类识别现象。我们将 SERS 纳米探针与特异性肿瘤靶向标志物 —— 表皮生长因子受体（EGFR，一种已知的人类纤维肉瘤细胞 HT-1080 靶向剂）偶联。这种纳米探针能高效靶向 HT-1080 细胞的表面标志物，从而证明其可作为超灵敏拉曼探针用于检测和靶向成像，且对正常细胞无影响。
结论与讨论
卤代氮杂 - 硼 - 二吡咯亚甲基衍生物 1-3 和氮取代衍生物 4-6 的合成以相应的查尔酮为起始原料，按照先前报道的方法进行，产率良好1。查尔酮经过硝基甲烷加成生成硝基加合物，该加合物与醋酸铵反应生成氮杂二吡咯亚甲基，随后与三氟化硼乙醚配合物（BF₃-OEt₂）络合，得到目标氮杂 - 硼 - 二吡咯亚甲基染料。卤代衍生物在约 600-750 nm 范围内表现出强吸收，在约 700-850 nm 处有荧光发射，而氮取代染料则显示出更大的红移吸收，位于约 700-800 nm 处。为研究氮杂 - 硼 - 二吡咯亚甲基染料作为拉曼探针的效率，在 1% 二甲基亚砜 / 水（DMSO/H₂O）中，使用 WI-Tec 拉曼显微镜，以 633 nm 激光激发和 20 倍物镜，记录了纯报告分子 1-6 的拉曼光谱1。在类似实验条件下，氮杂 - 硼 - 二吡咯亚甲基衍生物 1-6 显示出特征性的、分辨率良好的拉曼光谱，且信噪比高。氨基取代的氮杂 - 硼 - 二吡咯亚甲基 4 表现出分辨率良好的强拉曼光谱图，信噪比高，且具有更好的亲水性和光稳定性。氮杂 - 硼 - 二吡咯亚甲基染料 4 在 1600-1610 cm⁻¹ 范围内表现出强信号，这归因于偶氮甲烷键的 C=NC 伸缩振动频率。通过浓度依赖性实验确定了氨基染料 4 的拉曼强度最低检测限，结果为 4 μM。有趣的是，与最常用的拉曼报告分子（如罗丹明 B 和结晶紫）相比，氨基衍生物 4 显示出增强的拉曼信号强度，这突显了氮杂 - 硼 - 二吡咯亚甲基染料作为商用拉曼标记用于生物成像应用的潜力。
鉴于氮杂 - 硼 - 二吡咯亚甲基染料在 633 nm 照射下显示出显著的拉曼强度，研究其在纳米金表面存在时的表面增强拉曼散射增强效应是有意义的。将氨基氮杂 - 硼 - 二吡咯亚甲基染料 4（30 μM）与制备的金纳米颗粒（尺寸约 40 nm）以 1:9 的体积比混合（金纳米颗粒的制备细节见实验部分）4。将混合物孵育 10 分钟，使氮杂 - 硼 - 二吡咯亚甲基通过化学吸附和物理吸附最大程度地吸附在金胶体上。我们观察到染料 4 通过氨基以及静电相互作用与金表面强烈结合。通过与母体氮杂 - 硼 - 二吡咯亚甲基染料以及胶体金溶液相比，吸收光谱的位移证实了金胶体 4-Au 的形成。如前所述研究了表面增强拉曼散射增强效应，与纯分子 4 观察到的正常拉曼强度相比，强度增加了约 10 倍。与市售拉曼报告分子相比，表面增强拉曼散射强度更高，这揭示了染料 4 作为拉曼标记分子的效率。通过浓度依赖性表面增强拉曼散射实验确定了 4-Au 的灵敏度，发现其低至 0.4 μM，在类似条件下比罗丹明 B（1 μM）和孔雀石绿（2.3 μM）更灵敏。
我们用氮杂 - 硼 - 二吡咯亚甲基和胶体纳米金构建了一种简单的生物相容性表面增强拉曼散射纳米标记，以促进表面增强拉曼散射成像（mapping）和癌细胞系与正常细胞系的光谱区分。通过用聚乙二醇（PEG）有效包封（4-Au@PEG）实现胶体的生物相容性，并在数天内检查其信号稳定性。我们观察到纳米结构在 25°C 下具有相当的稳定性。聚乙二醇包封通过修改先前描述的方案进行。将杂环功能连接剂 HS-PEG-COOH（聚乙二醇分子量：3000 Da）添加到 4-Au 溶液中，然后将金胶体暴露于过量的 PEG-SH（聚乙二醇分子量：5000 Da）中 15 分钟。随后，氮杂 - 硼 - 二吡咯亚甲基报告分子 4 被有效地掺入聚乙二醇薄层中，并通过紫外 / 可见吸收光谱证实，与 4-Au 相比，其吸收最大值偏移约 4 nm。4-Au@PEG 的高分辨率透射电子显微镜（HR-TEM）分析显示，金纳米颗粒表面周围有一层厚度约 2-3 nm 的聚乙二醇层，聚乙二醇包封后尺寸从 43 nm 增加到 46 nm。动态光散射（DLS）测量也支持透射电子显微镜实验的观察结果，纯金纳米颗粒的直径约为 40-45 nm。然而，聚乙二醇包封导致颗粒分布更宽，这可能是由于周围的水介质。
我们探究了聚乙二醇化拉曼探针 4-Au@PEG 在癌细胞系中的靶向拉曼成像，并确定了该拉曼探针在活癌细胞中的特异性。借助共聚焦拉曼显微镜，在三种癌细胞系（人乳腺癌细胞 HeLa、人肺癌细胞 A549、人纤维肉瘤细胞 HT1080）以及作为对照的正常细胞系 3T3L1 中，对其体外细胞检测及成像能力进行了研究。用于细胞成像时，将 20 μL 的 4-Au@PEG 加入到 chamber slide 中的细胞中，并在 37℃下孵育 1 小时。用 PBS 缓冲液洗涤以去除未结合的纳米标记后，进行单光谱分析和成像研究。通过将激光束聚焦在细胞表面沿 X 和 Y 方向的成像区域，记录表面增强拉曼散射成像。图中展示了 HeLa 细胞系的明场、拉曼和聚类图像，分别展示了 A549 和 HT1080 癌细胞系相应的明场、拉曼和聚类图像。基于每种癌细胞系的特征拉曼光谱扫描进行聚类分析，推测拉曼纳米标记可能定位于细胞表面区域附近。从三维拉曼和单光谱分析中可以更清楚地看出 4-Au@PEG 在细胞表面附近的定位，这些分析给出了氮杂 - 硼 - 二吡咯亚甲基探针 4-Au@PEG 的特征表面增强拉曼散射峰。此外，我们在类似条件下检查了拉曼探针在正常 3T3L1 细胞中的潜在定位，按照上述方法孵育 4-Au@PEG。有趣的是，拉曼光谱和成像模式大多仅显示出缓冲液背景中存在纳米标记，在细胞表面或细胞内区域未观察到此类识别。因此，我们能够证明 4-Au@PEG 对不同癌细胞的选择性识别，突显了氮杂 - 硼 - 二吡咯亚甲基探针 4 的拉曼标记优势。
我们研究并验证了拉曼探针 4-Au@PEG 在人纤维肉瘤（HT1080）癌细胞的体外靶向细胞检测和成像中的选择性识别。在此方面，将 4-Au@PEG 与抗表皮生长因子受体（EGFR）的小鼠单克隆抗体偶联，该抗体在纤维肉瘤癌细胞系的细胞表面大多过表达。该抗体用于识别相应抗原上的外部表位。使用成熟的 EDC-NHS 偶联策略实现了抗体的成功偶联（详情见实验部分）。杂功能聚乙二醇与抗体的游离胺末端共价偶联，这通过紫外 / 可见吸收光谱得到证实。偶联抗体的纳米标记的吸收光谱在 280 nm 左右出现蛋白质吸收峰，这清楚地表明了表面增强拉曼散射纳米标记 4-Au@PEG-EGFR 的抗体偶联。此外，我们使用偶联抗体的表面增强拉曼散射纳米标记 4-Au@PEG-EGFR 检查了对 HT1080 癌细胞系的识别。实验通过将拉曼标记与 HT1080 细胞在 chamber slide 中孵育 1 小时进行，用 PBS 洗涤去除未结合的纳米标记后，记录表面增强拉曼散射光谱模式和成像。通过单光谱分析观察到 4-Au@PEG-EGFR 在细胞表面的聚集，其中我们观察到探针的指纹表面增强拉曼散射峰。代表性细胞的明场图像以及相应的拉曼图像和彩色编码三维拉曼图像如图所示，这些图像表明偶联抗体的氮杂 - 硼 - 二吡咯亚甲基探针 4-Au@PEG-EGFR 能有效识别 HT1080 细胞表面。通过两个聚类（a 和 b）对特征拉曼图像进行分析后的聚类成像如图所示。从聚类图像中提取的光谱在细胞表面（a）显示出纳米标记的特征指纹表面增强拉曼散射峰，而在细胞核（b）中则没有，这表明它们有效地定位于 HT1080 细胞表面。直方图图像显示了来自化学吸附在金纳米颗粒基底上的拉曼报告分子的最强峰（I₁₆₀₆/I₁₃₄₂）的统计表示。靶向纳米标记的识别反映在强成像中，其中 4-Au@PEG-EGFR 主要定位于细胞表面，这证明了基于氮杂 - 硼 - 二吡咯亚甲基 4 的拉曼探针对癌细胞的靶向识别选择性。此外，我们证实了 4-Au@PEG-EGFR 与 EGFR 阳性的 HT1080 细胞的有效结合，相比之下，正常细胞系 3T3L1 的 EGFR 表达最低。通过在相同实验条件下将拉曼探针 4-Au@PEG-EGFR 与 EGFR 表达较低的小鼠成纤维细胞 3T3L1 细胞孵育，进行了对比结合实验。
总结
我们研发了一系列在近红外区有吸收的氮杂 - 硼 - 二吡咯亚甲基（aza-BODIPY）染料，这些染料在周边苯环上具有不同取代基，可作为具有多重信号模式的拉曼探针。其中，氨基取代的衍生物 4 表现出最高的拉曼信号强度，灵敏度达 4 μM，且信噪比优异。有趣的是，氮杂 - 硼 - 二吡咯亚甲基 - 金纳米颗粒偶联物 4-Au 显示出增强的拉曼信号，灵敏度极高，检测限可低至 0.4 μM。此外，我们发现 4-Au@PEG 能特异性识别 HeLa、A549 和 HT1080 等不同癌细胞，而对正常的 3T3L1 细胞无此识别作用。我们还构建了一种独特的靶向表面增强拉曼散射（SERS）纳米探针 4-Au@PEG-EGFR，它与靶向特异性表皮生长因子受体（EGFR）抗体偶联，证实了其对 HT1080 细胞系的特异性识别。该纳米探针 4-Au@PEG-EGFR 能高效识别人类纤维肉瘤细胞系，且对正常细胞无影响，从而有助于实现对癌细胞的超灵敏检测和靶向拉曼成像。
参考文献
Unveiling NIR Aza-Boron-Dipyrromethene (BODIPY) Dyes as Raman Probes: Surface-Enhanced Raman Scattering (SERS)- Guided Selective Detection and Imaging of Human Cancer Cells,Nagappanpillai Adarsh, Adukkadan N. Ramya,Kaustabh Kumar Maiti,*and Danaboyina Ramaiah*,Chem. Eur. J. 2017, 23, 14286 – 14291,DOI: 10.1002/chem.201702626
