内容提要
本文提出一种基于极性敏感探针（LD660）的荧光寿命成像方法，用于分析脂滴的脂质组成。该探针仅在介电常数为 2-4 的非极性脂滴环境中，于 660nm 处发射强荧光，在脂滴成像方面表现优于尼罗红。重要的是，LD660 的荧光寿命会随着中性脂质混合物中胆固醇酯比例的增加而延长。利用配备 LD660 的荧光寿命显微镜，我们对细胞和组织中的脂滴胆固醇酯比例进行了成像和定量分析。研究发现，在脂肪肝疾病中，巨噬细胞以及周围的肝细胞，其胆固醇酯含量显著高于其他肝细胞。
结果与讨论
基于呫吨的探针设计与合成
为了实现探针在脂滴中的高富集，首先考虑了其亲脂性。计算得出的分配系数（Clog P）已被广泛用于评估化合物的亲脂性。我们之前的综述指出，Clog P 约为 6 的荧光团可能是用于脂滴染色的最佳选择。脂滴标记物的另一个理想特性是对极性敏感的荧光生成特性。已知脂滴（介电常数约为 2 - 4）与内质网（介电常数约为 4.8 - 18.5）相比极性较低。因此，在介电常数约为 4 时发出荧光的阈值，对于实现高信噪比是较为理想的。然而，市售的脂滴标记物，如尼罗红和 BODIPY 493/503，在这个介电常数范围内未能表现出足够的荧光生成响应。为了增强对极性敏感的荧光生成特性，我们试图通过增加分子的不对称性来促进分子内电荷转移。在这种情况下，被激发和极化的分子只会在非极性溶剂中发射荧光，而在极性溶剂中耗散能量。呫吨荧光团由于其高亮度和化学多样性，在荧光显微镜中得到了广泛应用，但尚未被充分开发用于脂滴标记物。因此，我们合理地将供电子基团引入到对称的呫吨结构（宾夕法尼亚绿，PG，Clog P = 3.69，一种内质网标记物）中，以上调其 Clog P，从而实现对脂滴的有效成像。甲基化（PG - Me）和氨基取代（PG - N，PG - P）使 Clog P 提高到 5.02。进一步引入 N,N'- 二甲基氨基苯基（LD620）和 N,N - 二甲基氨基苯乙烯基（LD660），分别将 Clog P 提高到 5.80 和 6.44。极性敏感的荧光生成特性我们对探针的极性敏感荧光生成特性进行了评估值得注意的是，它们在 1,4 - 二氧六环 / 水混合物中对极性表现出明显不同的荧光响应。PG 的荧光强度随着水的体积分数增加而单调上升，并在 100% 水（介电常数约为 80.1）中达到最大值；然而，PG - Me 在 80% 水（介电常数约为 64.5）中显示出最高的荧光强度。相比之下，PG - N 和 PG - P 分别在 6% 水（介电常数约为 6.9）和 4% 水（介电常数约为 5.3）中表现出最大强度。LD620 和 LD660 在 100% 1,4 - 二氧六环（介电常数约为 2.2）中均显示出最强的荧光。重要的是，发射波长较长的 LD660 对低极性介质极为敏感。在含有 2% 水（介电常数约为 3.8）的混合物中，LD660 的荧光强度骤降至其在 1,4 - 二氧六环中最大强度的约 10%。相比之下，尼罗红需要 70% 的水（介电常数约为 56.7）才能实现 90% 的荧光猝灭。在不同有机溶剂中的荧光测试也证实了 LD660 比尼罗红对极性变化更为敏感。例如，在极性与内质网相似的氯仿和二氯甲烷中，LD660 的荧光显著猝灭，而尼罗红的荧光强度与在 1,4 - 二氧六环中几乎相同。LD660 对极性更高的敏感性，有利于提高脂滴成像中的信噪比。此外，我们测试了 LD660 对 CE/TAG 混合物中 CE 比例是否足够敏感。在这里，由于油酸胆固醇酯和油酸甘油三酯在大多数细胞中含量较高，故将它们分别作为代表性的 CE 和 TAG。LD660 的荧光强度随着 CE 含量的增加而增强，这与 CE 的极性低于 TAG 的事实相符。
LD660 对脂滴的卓越成像性能
在共定位实验中，我们发现 PG - Me 的荧光分布与 PG 几乎相同。与内质网示踪剂红色荧光（ER - Tracker Red）的共定位，进一步证实了 PG - Me 与 PG 一样，具有作为内质网标记物的能力。对于 PG - N 和 PG - P，它们产生分散的荧光，并带有一些亮点，并且与内质网红色荧光和尼罗红的共定位效果都很好（皮尔逊系数≥0.9。相比之下，疏水性更强的 LD620 和 LD660 显示出清晰离散的荧光点，与 BODIPY 493/503 的共定位良好（皮尔逊系数分别为 0.96 和 0.97）。此外，将脂滴的膜蛋白 —— 脂肪细胞分化相关蛋白（ADRP）与绿色荧光蛋白（EGFP - ADRP）融合，并与 LD660 进行双色成像LD660 的红色荧光点被 EGFP - ADRP 的绿色荧光圈所环绕，明确证实了 LD660 染色的点就是脂滴。由于探针 LD660 具有较长的波长和较大的斯托克斯位移，因此我们选择它而非 LD620，并将其脂滴成像性能与尼罗红进行比较。如前所述，LD660 与 BODIPY 493/503 的皮尔逊系数高达 0.97，但与内质网、线粒体和溶酶体示踪剂的系数分别仅为 0.29、0.31 和 0.09。然而，尼罗红的特异性较差，因为它与其他细胞器示踪剂的皮尔逊系数均高于 0.5更重要的是，与尼罗红相比（信噪比约为 3.2），LD660 显示出极高的对比度（将脂滴的平均荧光强度与细胞质的平均荧光强度之比定义为信噪比，LD660 的信噪比约为 9.1），这可能归因于 LD660 更好的极性敏感荧光生成特性。除了活细胞成像，我们还评估了 LD660 在固定细胞中的标记性能，结果表明 LD660 在固定细胞中也具有很强的标记脂滴的能力。
通过荧光寿命成像显微镜（FLIM）定量细胞脂滴的脂质组成
为了研究 LD660 在 FLIM 中的应用，我们使用单指数衰减法测定了 LD660 在不同有机溶剂中的荧光寿命（τ）。从非极性的甲苯到中等极性的二氯甲烷，LD660 的寿命从 2.61 ns 下降到 0.25 ns，而尼罗红的寿命变化较小（表 S2）。此外，LD660 的荧光寿命在 1,4 - 二氧六环中为 2.61 ns，在含有 1% 水的 1,4 - 二氧六环 / 水混合物中降至 1.17 ns。相应地，在 CE/TAG 混合物中，荧光寿命从 TAG 中的 2.33 ns 增加到含有 60% CE 的 CE/TAG 混合物中的 2.53 ns。这些观察结果促使我们利用 LD660 结合 FLIM 来研究脂滴的脂质组成。
首先，利用 FLIM 对含有不同 CE 比例的人工脂滴进行成像。随着 CE 含量的增加，LD660 的荧光寿命从 1.73 ns 显著增加到 2.08 ns。然后，对完整的 HepG2 细胞进行 FLIM 成像，其平均荧光寿命为 1.96 ± 0.18 ns。接下来，我们使用油酸（OA）和胆固醇（chol）诱导细胞中 TAG 和 CE 的合成。结果，用 OA 孵育的细胞荧光寿命为 1.83 ± 0.05 ns，用 chol 孵育的细胞荧光寿命为 2.14 ± 0.06 ns。值得注意的是，完整细胞的脂滴荧光寿命表现出明显的细胞间异质性，而用 OA 或 chol 孵育的细胞荧光寿命分布较窄，这意味着完整细胞内的脂质组成差异更大。这些信息从基于荧光强度的图像中是无法获得的的 CE 比例为 0.47，OA 孵育细胞中为 0.20，chol 孵育细胞中为 0.87。同时，进行了薄层层析（TLC）以验证细胞样品中脂质组成的变化。对脂质混合物进行测试以建立校准曲线。然后通过 TLC 分析细胞裂解物，得到了一致的结果。此外，我们检测了泡沫细胞中 CE 比例的变化。将 RAW 264.7 细胞与氧化低密度脂蛋白孵育 24 小时，导致荧光寿命显著增加。另一方面，添加甲基 - β - 环糊精几乎使荧光寿命恢复到基线水平。综上所述，这些发现表明 LD660 可作为一种可靠的 FLIM 探针，用于测定细胞内脂滴的 CE 含量。
总结
我们的研究开发出了一类新型的呫吨荧光团，并引入了 LD660 作为一种出色的荧光探针用于脂滴成像。LD660 具有显著特性，如长波长（660nm）、大斯托克斯位移（148nm）以及高特异性。借助荧光寿命成像显微镜（FLIM），LD660 实现了在细胞和组织层面，对脂滴中胆固醇酯（CE）组分的成像和定量分析。通过该方法，我们首次发现，与脂肪变性的肝细胞相比，脂肪肝中的巨噬细胞具有更高的 CE 含量。
参考文献
Analyzing the Cholesteryl Ester Fraction in Lipid Droplets with a Polarity-Ultrasensitive Fluorescence Lifetime Probe， Sijia Lu, Yanyan Zhao, Diankai Liu, Zixu He, He Li, Wei Zhang, Xiaohua Li, Huimin Ma, and Wen Shi*，Anal. Chem. ，https://doi.org/10.1021/acs.analchem.4c06472
