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内容提要

    本研究基于 MPO-H₂O₂-Cl⁻体系催化的环氧化生化反应，筛选出高选择性MPO探针（CSQ），通过将其整合到含/不含肝靶向基团的下转换纳米颗粒（DCNPs）上，构建了双近红外-IIb（NIR-IIb）比率I（808 激发/980 激发下 1550 发射）发光纳米探针（双 NIR-IIb 纳米探针）。肝靶向探针用于监测 MPO 释放，非肝靶向探针则评估所有细胞类型的 MPO 活性。利用该双探针系统发现：四氯化碳（CCl₄）诱导的 ALI 中，MPO 介导的氧化应激在 12 小时内持续升高；而对乙酰氨基酚（APAP）诱导的 ALI 中，该氧化应激先升高并在 3 小时达峰，随后 12 小时内迅速恢复至正常水平。

高选择性近红外 HOCl 分子探针的设计

   髓过氧化物酶（MPO）在脂质过氧化和脂蛋白氧化过程中发挥着关键作用。在这个过程中，MPO - H₂O₂ - Cl⁻体系或生成的 HOCl 能够快速催化不饱和脂肪酸和磷脂（如油酸和胆固醇），以相近的速率形成脂肪酰氯醇，在此反应中，脂质中的氯醇可进一步发生 HCl 消除反应，生成环氧化物。利用这一独特的生化反应作为 HOCl 的识别机制，我们精心设计并筛选了一系列含有烯基的近红外荧光团，包括 CS 染料、HD 染料、BODIPY 染料、氮杂 BODIPY 染料、菁染料、硅罗丹明、方酸菁染料以及其他近红外荧光染。随后，在缓冲溶液（PBS/乙醇 = 7:3，pH = 7.4）中测量了它们对 ROS（如 HOCl、・OH、O₂⁻和 H₂O₂ ）、RNS（如 ONOO⁻）和 RSS（如 H₂S、SO₃²⁻和 GSH）的吸收光谱。除了化合物 7、8 和 10，其余化合物对 HOCl、・OH 和 ONOO⁻中的一种或多种活性物质不稳定。值得注意的是，只有化合物 11（命名为 CSQ）对 HOCl 表现出选择性响应。质谱和吸收光谱表明，HOCl 与 CSQ 中的烯基迅速反应形成环氧化合物，导致吸收波长发生显著蓝移（545nm），这也与我们提出的识别机制相符。同时，我们还验证了 CSQ 对 MPO - H₂O₂ - Cl⁻体系的响应。

双近红外 IIb 纳米探针的构建与表征

   我们基于 808/980nm 的双激发比率荧光，设计了具有不同靶向性的双近红外 IIb 纳米探针。X 射线衍射表明，油酸包覆的核心和核壳型下转换纳米颗粒（DCNPs）的晶型为 β 型六面体结构。的透射电子显微镜（TEM）图像显示，各种纳米材料的形状高度均匀且分散良好。为了将 CSQ 修饰到纳米材料表面，我们合成了 CSQ - COOH。表明 CSQ - COOH 对 HOCl 保持了高选择性和敏感性。为了将 CSQ - COOH 接枝到 DCNPs 表面，我们去除了 DCNPs 表面的油酸并用聚乙烯亚胺（PEI）取代，以便 CSQ - COOH 能够共价接枝到 DCNPs 表面，从而合成 DCNPs@PEI@CSQ。考虑到 PEI 残留的NH₂对 HOCl 的屏蔽作用以及纳米探针对肝细胞的靶向能力，我们将聚乙二醇（PEG）或聚乙二醇 - 半乳糖（PEG - Gal）接枝到 DCNPs@PEI@CSQ 上，以合成双近红外 IIb 纳米探针。PEG - Gal 通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI - TOF/MS）进行了合成表征，傅里叶变换红外光谱和 zeta 电位光谱的结果间接证明了 PEI、CSQ、PEG 和 PEG - Gal 已成功接枝到纳米颗粒上。此外，双近红外 IIb 纳米探针的水化直径经计算为 123 - 143nm，适合后续的生物成像应用。然后，我们研究了双近红外 IIb 纳米探针对 HOCl 的传感性能。示了近红外 IIb 纳米探针 1 的荧光滴定曲线，随着 HOCl 的加入，在 808nm 激发下，纳米探针在 1550nm 处的发射峰逐渐增强，而在 980nm 激发下 1550nm 处的发射保持不变，荧光比率随着 HOCl 浓度的增加而增加。相应地，近红外 IIb 纳米探针 2 对 HOCl 也有类似的比率荧光滴定曲线。

双可见光谱纳米探针的活细胞 MPO 活性成像及肝靶向性能

   为确保探针满足细胞成像的要求，我们利用 CSQ 的宽吸收光谱，基于 CSQ 与NaYF₄，Yb20%，Er2%，Tm0.2%@n（上转换纳米颗粒，UCNPs）之间的福斯特共振能量转移（Förster Resonance Energy Trasfer ），构建了双上转换纳米探针（双可见光谱纳米探针）。该探针在 980nm 激发，发射波长处于可见光谱范围内。结构表征证实双可见光谱纳米探针已成功合成，UCNPs@PEI@CSQ@PEG（可见光谱纳米探针 1）和 UCNPs@PEI@CSQ@PEG - Gal（可见光谱纳米探针 2）在加入 HOCl 后，660nm 和 810nm 处的发射峰均逐渐增强。将 CSQ 接枝到 UCNPs 表面后，纳米探针对 HOCl 仍保持良好的选择性。即使ONOO^-含量达到 100μM，或者H₂S、・OH 含量达到 200μM，也不会干扰 HOCl 的检测。随后研究了双可见光谱纳米探针的肝靶向性能及其对分析物的响应。非靶向的可见光谱纳米探针 1 能够进入 BRL 细胞（大鼠肝实质细胞）和 RAW264.7 细胞（小鼠单核巨噬细胞）。而肝靶向的可见光谱纳米探针 2 只能进入 BRL 细胞，不会被 RAW264.7 细胞摄取。这些结果表明，接枝半乳糖的纳米探针（可见光谱纳米探针 2）对过表达去唾液酸糖蛋白受体的肝细胞具有选择性，可用于特异性成像肝实质细胞中 HOCl 的变化。为验证纳米探针对 HOCl 的响应性能，将可见光谱纳米探针 1 应用于细胞中外源 HOCl 的成像。随着 HOCl 浓度的增加，红色通道的荧光逐渐增强，这与光谱实验结果一致。随后，评估了纳米探针对不同类型细胞中内源性 HOCl 的响应。已有研究报道，用细菌内毒素脂多糖（LPS）和促炎细胞因子干扰素 - γ（IFN - γ）处理可诱导细胞内氧化应激升高和 ROS 水平增加。与未处理的 RAW264.7 细胞（B1）相比，LPS/IFN - γ 处理的细胞（B2）荧光增强，并且加入 MPO 特异性抑制剂 4 - 氨基苯甲酸（ABAH）后，荧光强度降低（B3）。

四氯化碳（CCL₄）诱导的急性肝损伤中髓过氧化物酶（MPO）分布和活性的探究

   我们进一步利用双近红外 IIb 纳米探针，在体内探究了CCL₄诱导的急性肝损伤中 MPO 的分布和活性。主要器官的苏木精 - 伊红（H&E）染色证实，除肺部外，双近红外 IIb 纳米探针在生物体内的毒性可忽略不计。为探究纳米探针肺部毒性的成因，我们研究了纳米探针在体内的生物分布和生物持久性，可以看出近红外 IIb 纳米探针 1 在肺部停留的时间更长，短期内会导致肺损伤。而近红外 IIb 纳米探针 2 在肺部的停留时间较短。为确认纳米探针是否会造成长期肺毒性，我们检测了肺损伤标志物乳酸脱氢酶，双近红外 IIb 纳米探针在短时间内不会造成肺损伤，且近红外 IIb 纳米探针 1 的损伤明显高于近红外 IIb 纳米探针 2。值得注意的是，12 小时后纳米探针引起的肺损伤基本可以忽略不计，这表明该纳米探针对小鼠的长期毒性较小。随后，将小鼠分为三组：对照组（用 PBS 处理）、急性肝损伤组（用CCL₄处理 3、6、12 小时）和肝损伤修复组（在CCL₄处理前用 N - 乙酰半胱氨酸（NAC）预处理）。在肝损伤组中，随着CCL₄注射时间的增加，近红外 IIb 纳米探针 1 的比率荧光从 3 小时开始逐渐增强，而近红外 IIb 纳米探针 2 的比率荧光从 6 小时开始逐渐增强。相应地，与肝损伤组相比，肝损伤修复组中双近红外 IIb 纳米探针的比率荧光显著降低，而对照组则保持不变。细胞实验结果表明，肝实质细胞中 MPO 表达较低，因此近红外 IIb 纳米探针 2 只能在进入肝实质细胞之前对 MPO 做出反应，这表明 MPO 已由中性粒细胞/库普弗细胞释放到细胞外液中。因此，CCL₄诱导的急性肝损伤中的荧光成像结果表明，MPO 介导的氧化应激在 12 小时内逐渐增强，CCL₄处理 3 小时后，MPO 逐渐从中性粒细胞/库普弗细胞释放到细胞外液中。为了验证体内成像的结果，我们随后分别用 Cy3 标记的 MPO 抗体和 FITC 标记的 CD11b 抗体，对CCL₄诱导的急性肝损伤组织中的 MPO 和中性粒细胞/库普弗细胞进行免疫荧光染色。与对照组相比，CCL₄注射后，肝组织中 MPO 的含量随时间逐渐增加。同时，我们还发现CCL₄诱导的急性肝损伤中，中性粒细胞/库普弗细胞的数量随时间急剧增加，这表明我们成功建立了肝损伤模型。更重要的是，在CCL₄注射 6 小时和 12 小时后的合并通道中，明显观察到 Cy3 标记的 MPO 和 FITC 标记的 CD11b 有许多不重叠的部分。这些结果表明，3 小时后，部分 MPO 可以从活化的中性粒细胞/库普弗细胞中释放出来，在肝组织液中催化Cl^-和H₂O₂生成OCl^-，这与近红外 IIb 纳米探针 2 的比率荧光增强相对应。因此，免疫荧光成像结果有力地验证了荧光成像结果的准确性。总体而言，我们通过双近红外 IIb 纳米探针，成功揭示了CCL₄诱导的急性肝损伤中，中性粒细胞/库普弗细胞中 MPO 的上调，以及上调后的 MPO 释放到肝组织液中的过程。双近红外 IIb 纳米探针可作为一种有效的工具，用于确定中性粒细胞/库普弗细胞是否释放髓过氧化物酶（MPO）。

总结

   我们提供了一种监测 MPO 释放的新方法，并通过双近红外 IIb 比率发光纳米探针成功揭示了CCl₄和 APAP 诱导的急性肝损伤中，MPO 介导的氧化应激存在明显差异。利用 MPO 独特的环氧化生化反应，我们经合理设计和筛选，初步筛选出对 HOCl 具有高灵敏度和选择性的小分子探针 CSQ。随后，将其接枝到纳米颗粒上，制备出具有不同肝细胞靶向性的双纳米探针。利用双近红外 IIb 纳米探针，我们发现 MPO 介导的氧化应激参与CCl₄和 APAP 诱导的急性肝损伤，并揭示了在这两种急性肝损伤中，MPO 的变化趋势以及从中性粒细胞/库普弗细胞释放的时间存在差异。

参考文献

Selective Twin NIR-IIb Ratiometric LuminescenceNanoprobes Enable the Accurate Visualization ofMPO-Mediated Oxidative Stress in Acute Liver Injury， Xiao Liu, Wei Li, Yang Shen, Linhui He, Huanhua Lai, Yushi Chen, LanLan Chen,*Xiao-Bing Zhang, and Lin Yuan， Adv. Funct. Mater. 2025, 35, 2414772，https://doi.org/10.1002/adfm.202414772